Белки спектрофотометрическое титрование

При помощи метода спектрофотометрического дифференциального титрования можно определить число фенолятных анионов и число —5 -групп, содержащихся в молекуле белка. Для этого устанавливают в кюветодержателе двухлучевого спектрофотометра две кюветы с денатурированным белком (на месте образца и на месте кюветы сравнения), причем рн раствора, находящегося в канале образца, делают равным И,О, а в канале сравнения — 7,5. Наблюдаемое в этих условиях различие оптической плотности при длине волны 295 нм связано с тирозином (фенолятная форма). При длине волны 243 нм различие в оптической плотности образцов будет уже обусловлено оттитрованными формами как тирозина, так и цистеина. В приведенной ниже таблице указаны значения молярных коэффициентов экстинкции для тирозина при обеих длинах волн и для цистеина при более короткой длине волны (анионные формы поглощают, тогда как протонированные формы не поглощают), Раствор белка имеет концентрацию 5,5-10" М. Различие в поглощении при 295 нм составляет 0,013, а при 243 нм—0,185. Определите число титрующихся тирозиновых и цистеиноБых остатков. Считайте, что толщина слоя всех растворов равна 1,00 см. [c.533]

Исследование диссоциации фенольных гидроксилов тирозина и сульфгидрильных групп цистеина в белках производится также спектроскопическим путем — методом спектрофотометрического титрования. При этом используется зависимость ультрафиолетового спектра поглощения этих остатков от состояния их ионизации. Степень ионизации при заданном значении pH определяется из соотношения [c.28]

Рис. 6.8. Спектрофотометрическое титрование метгемоглобина (Ме1НЬ) инози-толгексафосфатом (1НР). При 512 и 649 нм поглощение комплекса увеличивается, а при 640, 618, 588 и 559 нм остается постоянным. Концентрация метгемоглобина в расчете на тетрамер (20 мкМ) примерно в 14 раз превышает константу диссоциации (1,4 мкМ) этого комплекса. Точка пересечения касательной к начальному участку кривой с плато дает стехиометрию связывания (в данном случае 1). Заметим, что этот простой метод нельзя использовать, если начальная концентрация белка не очень сильно превышает константу диссоциации, поскольку предполагается, что весь лигаид связы вается белком сразу после добавления.

Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен. [c.177]

Еще слишком мало достоверных данных получено относительно макромолекулярной организации нуклеиновых кислот и белков в нуклеопротеидах. В дезоксинуклеогистонах и родственных им комплексах основной белок в большей или меньшей степени закручен вокруг ДНК, которая в нуклеопротеиде имеет ту же конформацию, что и в изолированном состоянии [360, 361, 408, 4091. Связывание фосфатных ионизированных групп с основными группами белка осуществляется, по-видимому, главным образом за счет солеобразных связей, так как при растворении в 1 М. растворе хлористого натрия нуклеопротеиды в значительной степени диссоциируют [362[. Спектрофотометрическое титрование нуклеогистона из зобной железы теленка фактически идентично титрованию свободной нативной ДНК при тех же значениях ионной силы [363]. По-видимому, большое значение имеют стереохимические факторы, которые определяют укладку белковых субъединиц в большой жело- [c.628]

Спектрофотометрическое титрование комплексов железа и меди с сидерофилином также показало значение тирозильных остатков в металлсвязывающей функции белка [75, 76]. В дифференциальных спектрах поглощения белка в ультрафиолетовой области в присутствии щелочи по сравнению со спектрами при нейтраль- [c.346]

Пример 14-Д. Спектрофотометрическое титрование белков. При многих исследованиях структуры белков возникает необходимость определения величины р/С диссоциации протонов ионизуемых боковых групп аминокислот, поскольку эти величины указывают на локализацию аминокислоты в белке (правило 2 в табл. 14-2). Это часто можно сделать спектрофотометрически, так как при диссоциации зачастую меняется спектр одного из хромофоров (например, в случае тирозина) см. рис. 14-7. Рассмотрим гипотетический тирозинсодержащий белок и для определения числа внешних тирозиновых остатков воспользуемся правилом 2 (табл. 14-2). Предположим, что в этом белке имеется пять тирозиновых остатков. Если все они расположены на поверхности и ионизуются при увеличении pH, спектр, отвечающий остаткам тирозина, будет приближаться к спектру свободного тирозина при высоких значениях pH, изображенному на рис. 14-7 (правило 26). Другими словами, зависимость "Огаз ( макс для ионизованной формы) от pH будет выглядеть, как кривая А на рис. 14-17. Когда же, наоборот, три тирозиновых остатка расположены внутри в неполярном окружении, полученная кривая аналогична кривой Б (правило 2а) отношение величины первого плато к конечной величине равно Отметим, что при очень высоких pH на кривой видно большое возрастание 0295. Это указывает на то, что внутренние тирозиновые остатки стали доступны растворителю, т. е. белок развернулся (денатурировал). [c.399]

Титрование остатков тирозина в белке можно провести спектрофотометрически. а. Объясните, как это можно сделать, б. При какой длине волиы (или длинах воли) вы стали бы проводить измерения в. Покажите, что для соединения с одной диссоциирующей группой и значениями коэффициентов молярной экстинкции енл и А для недиссоциированной и диссоциированной форм соответственно выполняется следующее соотношение (е — кажущаяся молярная экстинкция при данном pH) [c.75]

ПЛОТНОСТИ при длине волны 295 нм, при которой коэффициент экстинкцин увеличивается при ионизации на 2300 см ммоль [45]. Это изменение вызвано смещением максимума и увеличением интенсивности длинноволновой полосы поглощения. Поскольку кривая титрования гидроксильной группы фенола может быть определена спектрофотометрически, кривую титрования аминогруппы определяют при вычитания кривой титрования фенольной группы из кривой суммарного титрования фенольной и аминогрупп. Этот же спектральный метод был применен для определения степени титруемости тирозиновых остатков в различных белках [46]. Аналогичную процедуру, основанную на спектральных изменениях, сопровождающих ионизацию меркаптанов, можно использовать для титрования цистеина (см. разд. 4.5), Если хромофор, измененный в результате присоединения или отщепления протона, приобретает способность поглощать в видимой области спектра и соответственно изменять цвет, то это позволяет использовать соединение, содержащее такой хромофор, в качестве цветного индикатора pH (см. разд. 4.3). [c.526]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология