Иммобилизация ферментов на BrN-сефарозе

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Для исследования вопроса о каталитической активности мономерных форм НАД-зависимых дегидрогеназ мы прибегли к методу иммобилизации олигомеров этих ферментов на нерастворимом носителе — в нашем случае сефарозе 4В. Иммобилизация должна была бы предотвратить реассоциацию мономеров дегидрогеназ, а также, по нашим предположениям, оказать на мономеры стабилизирующее действие и, следовательно, помешать их инактивации. До начала нашей работы в литературе имелись противоречивые сведения о свойствах иммобилизованных мономеров одной из НАД-зависимых дегидрогеназ — лактатдегидрогеназы. В одной работе были получены иммобилизованные ковалентно на пористом стекле мономеры лактатдегидрогеназы, обладающие довольно низкой удельной активностью [6, 7], а в другой — полностью неактивные мономеры [8]. Мы изучали каталитические свойства иммобилизованных мономеров глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из двух различных источников, а также мономеров лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27). [c.81]

Среди способов иммобилизации наиб, распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель, В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстраиовые гели (сефарозу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетич. полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, напр., бромциаиом, азотистой к-той или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, к-рые способны вступать в р-цию сочетания, взаимод. с группами ННг, ОН, СООН, Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид. [c.215]

Для иммобилизации ферментов используют захват их полиакриламидным гелем и иными полимерами при полимеризации составляющих их мономеров, а также захват гелями, возникающими при желатинизации природных полимеров, например полисахаридов морских водорослей присоединение ферментов к целлюлозе, сефарозе, сефадексу, крахмалу, декстрану, агарозе и другим полисахаридам, активированным цианбромидом и другими агентами привязку ферментов к стеклянным бусинкам через диазосоединение ковалентное связывание фермента с азидными и гидразидными группами сополимера акриламида и акрилгидразина (энзакрила) и других носителей соединение фермента с гидратированными оксидами металлов, производными поливинилового спирта, альдегидными и диазогруппами модифицированных фенольных полимеров, силикагелями и многими другими материалами. [c.141]

Аффинную очистку метилаз вели на сорбенте, полученном иммобилизацией SAH на сефарозе. Исходной матрицей служила AH-Sepharose 4В . Спейсер активировали присоединением остатка бромуксусной кислоты в] реакции с О-бром-ацетил-К-оксисукцинимидом. SAH фиксировали инкубацией с суспензией активированного сорбента в течение 3 сут при комнатной температуре. Частично очищенный фермент сорбировали на ВАН-сефарозе в 0,005 М Na-фос-фатном буфере (pH 6,2) с 5 мМ ЭДТА и 2,4 мМ -меркаптоэтанола. Биоспецифи-ческую элюцию вели раствором субстрата — 0,02 мМ SAM в том же буфере. [c.432]

В работах с мечением белков флуоресцеином для их обнаружения показана однородность распределения белков в геле. Однако Дэвид и др. [15], которые исследовали распределение белка методом радиоавтографии Ч-меченой перокспдазы, связанной с сефарозой, не обнаружили связывания фермента внутри гранул сефарозы. Лаш и др. [46] нашли, что расхождения объясняются не методами обнаружения белка, а разными методами его иммобилизации. Используя электронную микроскопию ферритииа, связанного с сефарозой, они продемонстрировали, что использование очень эффективного метода связывания, а именно большого избытка ферритина в ходе связывания (>50 мг/мл), с эффективностью связывания >90% приводит к вогнутой кривой распределения ковалентно связанного ферритина, в то время как при эффективности связывания >50% наблюдается снова однородное распределение связанного ферритина. [c.256]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Установлено, что при использовании в реакции иммобилизации 2,5 и 0,5 мкмоль растворимого лиганда на 1 мл сефарозы количество лиганда, присоединенного к бромоцианактивированной сефарозе в описанных выше условиях, в одном случае составляло 1,5 и 0,3 мкмоль/мл сефарозы [16], Емкость приготовленного сорбента устанавливалась путем насыщения известного количества иммобилизованного лиганда чистой нуклеазой стафилококков, Связанный белок элюировали и определяли его количество по ферментативной активности. С матрицами, содержащими 1,5 и 0,3 мкмоль лиганда/мл сефарозы, связывалось 8 и 1,2 мг нуклеазы/мл сефарозы. Зная содержание фосфата в сорбентах и принимая, что фермент связывается с иммобилизованным лигандом в молярном соотношении 1 1 [16], можно рассчитать, что максимальное теоретическое связывание фермента с сорбентом составляет 28 и 6 мг/мл соответственно. При аналитическом элюировании [c.228]

Более сложная ситуация наблюдалась нами с лататдегидро-геназой из скелетных мышц свиньи при ее иммобилизации на активированной ВгСЫ сефарозе [11]. При иммобилизации лактатдегидрогеназы на сефарозе Чан с соавт. обнаружили, что с матрицей связывается димерная форма фермента [8]. Аналогичные результаты были получены в нашей работе при иммобилизации препаратов лактатдегидрогеназы, хранившихся в течение года [c.83]

Непосредственно после иммобилизации с матрицей связывается тетрамерная форма фермента, но 16-часовая инкубация препарата при 4° С приводит к его диссоциации на димеры. Дис социация свежего препарата лактатдегидрогеназы, иммобили зованного на сефарозе, происходит в незначительной степени [11] [c.83]