Ферменты иммобилизация

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем — наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов. [c.90]

Если холинэстераза иммобилизована с помощью ковалентного связывания, то срок службы биосенсора возрастает Так, датчик, состоящий из рН-электрода с иммобилизованной на поверхности ацетилхолинэсте-разой (путем сшивки глутаровым альдегидом с альбумином), функционирует без изменения характеристик достаточно длительное время. С его помощью определяли паратион и севин на уровне 10 - 10моль/л Продолжигельность анализа 30 мин. Содержание паратиона и севина контролировали по относительному снижению отклика сенсора после внесения в ячейку аликвоты пробы. Заметим, что величина измеиения pH зависит не только от активности фермента, но и от буферной емкости раствора. Поскольку увеличение кислотности происходит лишь на мембране, а в объеме раствора pH остается практически постоянным, обычно применяют высокие (до 0,1 моль/л) концентрации субстрата и ячейки большого (100 мл и выше) объема. Кроме глутарового альдегида для иммобилизации холинэстеразы используют сополимеры акрил- и метакриламида, желатин. В последнем случае стеклянный шарик рН-электрода погружают в 5-10%-й раствор желатина, содержащий фермент, затем высушивают и обрабатывают водным раствором глутарового альдегида. Аналогичные мембраны используют и в датчиках на основе рН-чув-ствительных полевых транзисторов (911. [c.294]

Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ. К ним относятся более высокая стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакц. среды и его повторного использования, а также возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках. Важное значение имеет относит, стабильность И. ф. к денатурирующим воздействиям-нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и др. Последнему подвержены протеолитич. ферменты Иммобилизация разобщает молекулы этих ферментов и полностью исключает такой процесс. Благодаря этому удалось изучить механизм образования протеолитич. фермента пепсина из его предшественника пепсиногена (при этом от последнего отщепляется пептид, состоящий из 42 аминокислотных остатков). Было показано, что эта р-ция катализируется самим пепсином. [c.216]

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, переведенные в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) их каталитической активности. Для иммобилизации ферментов применяют следующие методы [c.267]

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Поставленные задачи решаются на основе современных методов исследования ферментов. Практическая направленность занятий связана с освоением различных методов регистрации скоростей ферментативных реакций, включающих использование сопряженных ферментных систем и метода радиоактивного анализа. С целью определения активности мембранных ферментов осваиваются техника получения различных субклеточных структур и приемы работы с различными типами детергентов. Проблемы структурного анализа ферментов решаются с привлечением методов избирательной химической модификации белков, флуоресцентных методов, а также методов ковалентной и адсорбционной иммобилизации на различных носителях, включая искусственные фосфолипидные мембраны (липосомы). Кроме того, осуществляется практическое знакомство с различными аспектами кинетического исследования ферментов осваиваются различные способы оценки кинетических параметров, ингибиторный анализ, проводится исслс- [c.329]

Модификацию носителя иногда проводят путем ковалентной пришивки к его поверхности молекул, являющихся специфическими лигандами иммобилизуемого фермента. Иммобилизация с использованием таких носителей достигается за счет образования прочного нековалентного комплекса между ферментом и связанным с носителем лигандом. Этот метод иммобилизации, получивший название аффинной сорбции, широко используется в лабораторной практике, например, для избирательного выделения ферментов из сложных смесей (аффинная хроматография). [c.54]

Важная особенность этого метода состоит в том, что добавление фермента в реакционную смесь во время образования геля сводит дезактивацию фермента к минимуму. Далее, ковалентное присоединение фермента к гелю обеспечивает а некоторой степени защиту от протеаз. Эта процедура проста и универсальна она может быть прямо использована для многих ферментных систем, а также для иммобилизации целых клеток и органелл. Наконец, гель может быть приспособлен для магнитной фильтрации, если при образовании геля использовать железосодержащую жидкость. [c.258]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Малую стабильность ферментов, выделяемых из органов животных, растений или культур микробов, повышают, осуществляя так называемую иммобилизацию ферментов. С этой целью ферменты вводят в среду, в которой протекают процессы полимеризации. После окончания полимеризации ферменты оказываются прочно закрепленными и долго сохраняют каталитическую активность. [c.363]

Для того чтобы обеспечить многократность использования ферментов, их подвергают иммобилизации. Иммобилизацией называют перевод ферментов, обычно растворимых в воде, в водонерастворимое состояние с сохранением их каталитической активности. Молекулу фермента присоединяют за счет образования ковалентной связи к какому-либо водонерастворимому носителю — целлюлозе, стеклу, бумаге, силикагелю, полистиролу и др. Можно также диспергировать фермент в геле какого-либо вещества. [c.450]

Химическое модифицирование поверхности кремнезема реакциями с силанольными и силоксановыми группами. Гидрофобизация поверхности реакциями с различными алкил-, алкенил- и арилхлорси-ланами. Прививка к поверхности органических модификаторов с концевыми гидрофильными и химически активными функциональными группами. Химическая иммобилизация ферментов в макропорах. Исследование поверхностных соединений методами инфракрасной спектроскопии и спектроскопии вторичной эмиссии. [c.89]

Для многих применений важно привить различные органические группы, способные -к дальнейшим реакциям. Среди таких групп рассмотрим группы с концевыми двойными связями (алкенильные группы) и с концевой аминогруппой. Привитые алкенильные группы можно использовать в последующих реакциях, в частности, в реакциях сополимеризации с различными мономерами, а аминные группы — в реакциях, нанример, с диальдегидами, применяемыми для иммобилизации ферментов. [c.103]

Химическое модифицирование поверхности макропористого кремнезема для иммобилизации ферментов [c.108]

Киселев А. В., Никитин Ю. С. Макропористые носители с жестким скелетом для иммобилизации ферментов, — Биологическая химия. — М. ВИНИТИ, [c.346]

Третьей областью применения теории саморазвития открытых каталитических систем может стать моделирование и перенесение в промышленные реакторы моделей ферментативных систем, представляющих если не всю, то часть живой клетки, обеспечивающей стабильную работу биокатализаторов. Речь идет об освоении каталитического опыта живой природы в том отношении, которое касается стабилизации ферментов и их синтетических аналогов не путем искусственной иммобилизации, а посредством закономерностей, присущих естественному отбору в ходе химической эволюции. [c.210]

Исключительно важное значение химия поверхности адсорбентов и носителей имеет в газовой и жидкостной хроматографии для анализа сложных смесей, препаративного выделения чистых веществ и управления технологическими процессами. Химия поверхности играет важную роль и в процессах, протекающих в биологических системах. К ним относится, в частности, взаимодействие биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, с рецепторами — местами их фиксации в организме. Изучение модифицирования поверхности необходимо для решения вопросов совместимости искусственных материалов с биологическими. Химическое модифицирование адсорбентов применяется при разработке эффективных методов вывода из крови разного рода токсинов (гемосорбция). Прививка к поверхности крупнопористых адсорбентов и носителей соединений с определенными химическими свойствами необходима для иммобилизации ферментов, их хроматографического выделения и очистки, а также для иммобилизации клеток. Иммобилизованные ферменты и клетки эффективно используются в промышленном биокатализе, обеспечивая высокую избирательность сложных реакций в мягких условиях. Очистка и концентрирование вирусов гриппа, ящура, клещевого энцефалита и других для получения эффективных вакцин требует применения крупнопористых адсорбентов с химически модифицированной поверхностью. [c.6]

Учитывая важное практическое значение иммобилизации ферментов, а также возможность использования иммобилизованных препаратов ферментов в фундаментальных исследованиях, в раздел включен ряд задач по иммобилизации препаратов ферментов, выделенных студентами самостоятельно. [c.196]

Адсорбционный механизм регуляции активности гексокиназы скелетной мышцы (И изозим гексокиназы) реализуется в повышении каталитической эффективности фермента вследствие нековалентной иммобилизации на митохондриальных мембранах. Связанная форма фермента по сравнению со свободной обладает большим числом оборотов, повышенным сродством к субстрату глюкозе и менее чувствительна к ингибирующему действию продукта реакции глюкозо-6-фосфата. Связь фермента с наружной митохондриальной мембраной осуществляется преимущественно с участием фосфолипидного компонента мембран и регулируется внутриклеточными метаболитами. Так, Mg + и глюкоза являются адсорбирующими фермент реагентами, АТФ и глюкозо-6-фос-фат (Г-6-Ф) солюбилизируют фермент, контролируя тем самым соотношение разных по каталитической эффективности форм фермента [c.374]

Для удобства применения холинэстеразы иммобилизуют в по.шмер-ные пленки или гели. При этом существенно увеличивается устойчивость фермента к влиянию внешних факторов. Так, при иммобилизагщи холинэстеразы в желатиновый гель срок ее хранения составляет 2-3 года, а при непрерьганой работе активность препарата падает на 20% лишь через 10 дней. Наряд) с повьпиением стабильности иммобилизация хо.пинэстераз обеспечивает многократное использование препарата. Заметим, что при определении необратимых ингибиторов, например фосфорорганических пестицидов, повторное использование фермента в каждом случае требует специальных исследований В качестве реактиваторов применяют гидро-ксиламин, оксимы и др [c.290]

Ферментные (энзимные) электроды представляют собой электродные устройства (ионометрические датчики), позволяющие определять концентрации веществ, участвующих в ферментативных реакциях. Для этой цепи на чувствительный элемент ионоселективного электрода или на специальный носитель, расположенный на некотором расстоянии от него, наносят спой, содержащий фермент. Обычно фермент применяют в иммобилизированном состоянии, используя один иэ методов иммобилизации ковалентное связывание с поверхностью электрода, внедрение фермента в сетку геля или полимера, ковалентную сшИвку молекул фермента между собой с помощью соответствующего полифунк-ционального реагента, [c.57]

В курсе приведены многочисленные примеры практического применения главным образом газовой и молекулярной жидкостной хроматографии на адсорбци-онно или химически модифицированных адсорбентах для анализа углеводородов, их производных и гетероциклических соединений. Особое внимание уделено анализу вредных примесей, разделению углеводов, стероидов, гликозидов, азолов, азинов, а также таких важных галогенпроизводных, как фреоны и пестициды. Адсорбция микотоксинов, представляющих собой одну из серьезнейших пищевых и кормовых проблем, рассматривается как в аспекте хроматографического их анализа, так и в аспекте хроматоскопического исслв1Дования структуры их молекул. В конце курса приведены примеры адсорбции и хроматографии синтетических и природных макромолекул. Здесь рассматривается иммобилизация некоторых ферментов и клеток (например, для осахарнвания крахмала, изомеризации глюкозы, для решения проблем искусственной почки), а также вопросы хроматографической очистки вирусов, в частности, вирусов гриппа и ящура. [c.4]

Для иммобилизации ферментов широко используют макропористые неорганические адсорбенты-носители, в частности, кремнеземные, поверхность которых предварительно обрабатывают обычно 7-аминопропилтриэтоксисиланом (7-АПТЭС). В результате модифицирования этим реагентом поверхность кремнезема становится гидрофильной и приобретает основной характер. Для получения аминированных кремнеземных адсорбентов и носителей по этой реакции модифицирование проводят обычно в растворах — в толуоле или в воде. Реакцию модифицирования кремнезема 7-ами-нопропилтриэтоксисиланом в безводном органическом растворителе (без добавления катализатора, поскольку имеются аминогруппы) можно представить следующей схемой [c.104]

При иммобилизации ферментов в макропористых кремнеземах (размеры пор должны значительно превышать размеры фермента) нйдо обеспечить, во-первых, химическую связь с поверхностью кремнезема и, во-вторых, достаточную подвижность фермента в среде, чтобы обеспечить доступ субстрата к каталитически активному центру фермента. Поэтому прививка фермента к поверхности должна быть произведена через достаточно длинную конформаци-онно подвижную цепь. Для соединения такой цепи с ферментом можно использовать аминогруппы полипептидных цепей белка. Поэтому к поверхности кремнезема следует привить модификатор, также содержащий концевые аминогруппы, а затем аминогруппы модификатора поверхности и фермента сшить друг с другом. Для [c.108]

Большое практическое значение имеет иммобилизация ферментов группы гидролаз, например превращающих крахмал в растворимые углеводы малой молекулярной массы (в сахара), изомери-зующих глюкозу во фруктозу (глюкозоизомераза) и др. [c.341]

В процессе химического взаимодействия с полимером возможно изменение, конформации молекулы фермента по сравнению с ее нативной структурой и его инактивация. Поэтому было изучено влияние процесса иммобилизации на акгивность и термостабршьность иммобилизованных [c.215]

На кафедре проводятся исследования по синтезу и изучению свойств синтетических неионных водорастворимых полимеров. Такие полимеры и гидрогели на их основе находят широкое применение в качестве флоку-лянтов для очистки сточных вод, для концентрирования и извлечения металлов, в качестве структурообразователей почв, в качестве плазмозаме-нителей, для стабилизации и очистки ферментов. Методом радикальной полимеризации синтезированы термоосаждаемые водорастворимые полимеры на основе винилкапролактама. Показано, что меняя природу со-мономера можно получать сополимеры с различной температурой фазового разделения., с различным конформационном состоянием макромолекул. При этом большое значение приобретает химическая природа растворителя. Способность к комплексообазованию таких полимеров позволило разработать способ получения гранулярного носителя и иммобилизации в него широкого спектра соединений, от пигментов до живых клеточных [c.115]

Аффинную очистку метилаз вели на сорбенте, полученном иммобилизацией SAH на сефарозе. Исходной матрицей служила AH-Sepharose 4В . Спейсер активировали присоединением остатка бромуксусной кислоты в] реакции с О-бром-ацетил-К-оксисукцинимидом. SAH фиксировали инкубацией с суспензией активированного сорбента в течение 3 сут при комнатной температуре. Частично очищенный фермент сорбировали на ВАН-сефарозе в 0,005 М Na-фос-фатном буфере (pH 6,2) с 5 мМ ЭДТА и 2,4 мМ -меркаптоэтанола. Биоспецифи-ческую элюцию вели раствором субстрата — 0,02 мМ SAM в том же буфере. [c.432]

В пособии (1-е изд.— 1979 г.) рассматриваются современные методы аналитической биохимии, основы препаративной энзимологии, методы изучения кинетики и механизмов регуляции ферментативных процессов, приемы иммобилизации ферментов и иммуноферментного анализа, а также методы, используемые при изучении метаболизма митохондрий и биоэнергетики. [c.2]

Растворы ферментов готовят непос едственно перед проведением иммобилизации суспензию фермента в сульфате аммония растворяют в буфере А (предпочтительно отцентрифугировать кристаллы фермента и их растворить в буфере А), затем обессоливают на колонке с сефадексом С-25 или 0-50, уравновешенным тем же буфером. Оптимальная концентрация фермента — около 1 мг/мл. Повышение концентрации [c.297]

В задаче исследуется взаимодействие изозима I гексокиназы скелетных мышц крысы с искусственной фосфолипидной мембраной (леци-тиновые липосомы), имитирующее поведение фермента при иммобилизации на биологической мембране. [c.374]