Белки реакции иммобилизации

Рассмотрим эти принципы более подробно. При наличии на поверхности носителя функциональных групп, способных вступать в химические реакции с функциональными группами фермента с образованием ковалентных связей получение иммобилизованного фермента сводится к исключительно простой процедуре, аналогичной используемой для физической адсорбции фермента на носителе. Методических различий здесь действительно нет в раствор фермента вводится носитель и фермент на нем адсорбируется, однако адсорбция при химической иммобилизации необратимая — фермент пришивается к носителю одной или несколькими ковалентными связями (рис. П,о). Тесный контакт белка с носителем может оказаться нежелательным, например, из-за неблагоприятного изменения микросреды фермента, стерических и диффузионных ограничений. Выходом из такой ситуации становится отдаление молекулы иммобилизованного фермента от поверхности носителя на некоторое расстояние. Для этой цели применяются сшивающие реагенты различной длины. Они могут быть как простыми бифункциональными (т. е. с двумя одинаковыми или различными по химической природе реакционноспособными группировками), так и весьма сложными полифункциональными реагентами, в том числе построенными из отличающихся по химической природе звеньев с различными по прочности связями между ними. Тем не менее зде сь используется один общий принцип ковалентной иммобилизации — сшивка фермента с носителем посредством сшивающего агента (рис. 11,6). [c.78]

Поставленные задачи решаются на основе современных методов исследования ферментов. Практическая направленность занятий связана с освоением различных методов регистрации скоростей ферментативных реакций, включающих использование сопряженных ферментных систем и метода радиоактивного анализа. С целью определения активности мембранных ферментов осваиваются техника получения различных субклеточных структур и приемы работы с различными типами детергентов. Проблемы структурного анализа ферментов решаются с привлечением методов избирательной химической модификации белков, флуоресцентных методов, а также методов ковалентной и адсорбционной иммобилизации на различных носителях, включая искусственные фосфолипидные мембраны (липосомы). Кроме того, осуществляется практическое знакомство с различными аспектами кинетического исследования ферментов осваиваются различные способы оценки кинетических параметров, ингибиторный анализ, проводится исслс- [c.329]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

В настоящее время не вызывает сомнения, что решающая роль в механизме кооперативной регуляции активности принадлежит конформационной подвижности белков. Поскольку иммобилизация иногда существенно ограничивает ее, то кооперативные и аллостерические свойства олигомерных ферментов в иммобилизованном состояния часто отличаются от свойств этих ферментов в гомогенном растворе. При этом иногда уменьшается или даже совсем исчезает 8-образный характер зависимости скорости реакции от концентрации субстрата или аллостери-ческого лиганда. Эти зависимости могут трансформироваться в сигмоидальные, которые характерны для ферментов, действующих в соответствии с кинетическим уравнением Михаэлиса — Ментен. [c.117]

В общем случае удобным приемом ковалентной иммобилизации ферментов путем образования дисульфидных мостиков является использование реакций тиол-дисульфидного обмена (при этом резко уменьшается вероятность закрепления неправильных дисульфидных внутримолекулярных мостиков в белке). Суть этого процесса можно выразить реакцией (21) [c.94]

Очевидно, что реакции ферментов, имеющих кинетические параметры в промежуточной области 10 л/(моль-с) условий эксперимента могут протекать как в диффузионном, так и в кинетическом режиме. Обычно иммобилизация ферментов на различных носителях приводит к образцам с содержанием белка 10—100 мг на грамм [c.74]

Модифицированные полимеры на акриламидной основе (см. разд. 31, 87) намного превосходят по инертности целлюлозные носители неспецифическая адсорбция белков проявляется на них значительно слабее. Для иммобилизации крупных лигандов применяют также исходные, немодифицированные полиакриламидные гели (см. разд. 31) — посредством реакции с глутаровым альдегидом (см. разд. 125/11). [c.228]

Несмотря на успешные опыты по стабилизации мембран хлоропластов (для этого применялась иммобилизация ферментов и закрепление их в пленках альгинатного геля и полиуретановых матрицах), они вряд ли войдут как составная часть в промышленные системы по улавливанию солнечной энергии. Тем не менее результаты изучения состава хлоропластов и обмена веществ в них могут послужить основой для создания таких систем. Чего же мы можем ожидать от исследований в этой области В реакциях фотолиза воды в мембранах хлоропластов,. идущих при участии фотосистемы II, принимает участие комплекс белков с хлорофиллом и магнием. Сегодня нам мало что известно и о расположении в нем ионов магния, и о механизмах фотолиза воды в растениях. [c.81]

ТОЧНОЙ вирулентности — способности вызвать инфекционную болезнь вместо того, чтобы предохранять от нее. К сожалению, пока остается проблема низкой иммуногенностн вакцин-антигенов. Одной из ее причин может быть то, что вакцина не включает всех компонентов возбудителя, необходимых для создания иммунитета к нему. Так, вирус, покидая клетку, часто одевается ее мембраной. Компоненты этой мембраны, отсутствующие в генно-инженерном белке, могут обладать нммуногеннымн свойствами. Повышению иммуногенностн вакцин-антигенов способствуют добавление адъювантов, иммобилизация вакцин на носителях или их включение в липосомы. Большинство экспериментальных подходов или направлений в биотехнологических исследованиях связаны с медициной и ветеринарией. Не ослабевает внимание ученых к поиску новых антибиотиков, что связано с токсичностью существующих препаратов, аллергическими реакциями, вызываемые ими, нарастанием устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым препаратам, а также с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых недостаточно эффективны известные антибиотики. [c.250]

Таким образом, чтобы оптимизировать активность и время отклика системы, необходимы тщательный выбор носителя и химического способа иммобилизации. Последний также должен быть совместим с конечной конфигурацией и технологией изготовления биосенсора. Наконец, даже если выбраны подходящие носитель и реакции, используемые для иммобилизации, сама иммобилизация может вызывать уменьшение конформационной подвижности и, следовательно, активности белка. [c.112]

Ключевым фактором успешного развития СВО-приборов для иммуноанализа является иммобилизация одного из компонентов иммунохимической пары на поверхности ЭВО. Методика иммобилизации должна не только удовлетворять таким требованиям, как воспроизводимость, захват большого количества белка, сохранение иммунохимической активности и устойчивости, но и не вызывать химических или физических изменений на поверхности, которые могли бы приводить к нежелательным оптическим эффектам (например, рассеянию света). Поскольку в большинстве работ по данному вопросу использовали кварц или стекло, мы ограничимся обсуждением только этих материалов. Кроме того, в дальнейшем мы будем рассматривать только иммобилизацию белков. На поверхностях ЭВО можно иммобилизовать и многие антигены небелковой природы. Для этого используют химические реакции, пригодные лишь для определенных соединений, поэтому здесь мы их также не будем обсуждать. Отметим, однако, один из подходов к решению данной проблемы, состоящей в том, что на ЭВО наносят белок (например, бычий сывороточный альбумин), с которым затем связывают его небелковый антиген [24]. [c.528]

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазо-ния, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Так, в щелочной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азосоединения, в составе которых белок связан с носрггелями [c.92]

Принцип, положенный в основу методов RIA [91, 117], аналогичен принципу методов ELISA эти методы в основном различаются тем, что для мечения вместо ферментов применяются радиоактивные элементы (главным образом йод) [49]. Широко используемый вариант этого метода не предусматривает иммобилизацию одного из реагентов реакция проходит в растворимой фазе, поэтому очень важным дополнительным этапом является отделение меченых реагентов, участвующих в иммунокомплексах, от тех, которые не участвуют. Если антиген представляет собой белок, обычно проводят разделение иммунокомплекса, осаждая его антителами к иммуноглобулинам кролика (если специфические антитела к белку индуцированы у кролика) [49]. [c.108]

Оптимальные условия связывания, pH, состав буферного раствора и температура, в значительной степени зависят от характера аффинного лиганда. Наиболее эффективно реакция проходит при pH 8—10, однако, если этого требует природа аффинного лиганда, можно использовать и более низкие значения pH. Аффинный лиганд, особенно белковой природы, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5), чтобы предотвратить неспецифическую сорбцию, например белка на белке, которая обусловлена полиэлектролитной природой белков. Для последующей отмывки сорбента используются растворы с более высокой ионной силой. Можно применять карбонатные или бо- ратные буферы с добавкой хлорида натрия. Количество присоединенного лиганда зависит от соотношения в реакционной смеси аффинного лиганда и объема геля, pH, природы самого лиганда (числа реакционноспособных групп и т. д.), а также от длительности проведения реакции и температуры. Например, при иммобилизации химотрипсина к 2 мл NBr-акти Вированной сефарозы при pH 8 присоединяется только 5 мг из 10 мг взятого белка, из 20 мг белка связывается примерно 8 мг, а из 30 мг — примерно 10 мг. При комнатной температуре (20— 25 °С) связывание обычно завершается за 2 ч, при пониженной температуре рекомендуется увеличить длительность реакции до 16 ч, т. е. оставлять реакционную смесь на ночь. В процессе связывания реакционную массу необходимо перемешивать, но применять магнитную мешалку не рекомендуется, так как при таком перемешивании можно разрушить гель. Лучше всего перемешивать реакционную смесь встряхиванием. Когда реакция закончится, гель переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же буферным раствором, в котором проводилось связывание. Оставшиеся активные группы рекомендуется блокировать, с этой целью гель обрабатывают 2 ч 1М этанола-мином при pH 8. Конечный продукт следует промыть 4—5 раз буферным раствором с высоким или низким pH. Например, можно использовать ацетатный (0,1 М, pH 4) или боратный буферный (0,1 М, pH 8,5) раствор, содержащий 1 моль/л хлорида натрия. Как уже упоминалось во введении, все нековалентно связанные соединения следует отмыть. [c.20]

О механизме проявления ИУК-оксидазной активности и о роли в этом процессе карбоксильных и аминогрупп пероксидазы, выделенной из трех различных объектов, пишут польские исследователи [Lobarzewski, Wolski, 1985]. Оказалось, что если пришивка фермента к матриксу осуществлялась по свободным аминогруппам, то ИУК-оксидазная активность у пероксидазы отсутствовала. Иммобилизация фермента через карбоксильные группы приводила к полному восстановлению этой активности. Поскольку в обоих случаях с матриксом связывали одинаковое количество пероксидазы, то потеря пероксидазой ИУК-оксидазной активности означала, что для протекания реакции окисления ИУК в активном центре пероксидазы необходимо присутствие свободных карбоксильных групп, которые in vivo могут связываться с аминными группами белка фермента. [c.15]

Но, конечно, нет правил без исключений. В природе встречаются белки, вообще не содержащие некоторых из приведенных на рис. 13 аминокислотных остатков, например цистеина. В пепсине, протеолитическом ферменте с молекулярной массой около 35 ООО имеются не два десятка, как этого можно было бы ожидать, а всего лишь две аминогруппы одна в-лизина и одна Л -концевая. Но недостаток одних групп на поверхности белковой молекулы компенсируется другими. В общем, количество функциональных групп в белках, доступных модифицирующим агентам, достаточно велико и, казалось бы, нет особых проблем для ковалентной иммобилизации белковой молекулы с использованием хотя бы одной из этих групп. Тем не менее проблемы существуют и не малые. Дело в том, что в процессе ковалентной иммобилизации должны участвовать только те группы молекулы белка, которые не существенны для его функции (в нашем случае — катализа). С этой позиции попытаемся выявить в белке группы-мишени, наиболее предпочтительные для целей ковалентной иммобилизации. Для этого используем следующие критерии. Во-первых, группы-мишени должны быть высокореакциоиноспо-собными, чтобы по возможности обеспечить избирательность реакции модификации, а также ее протекание в мягких неденатурирующих условиях. Во-вторых, таких групп в белке должно быть достаточно много, чтобы обеспечить широкие возможности для введения новых химических связей в белковую молекулу с регуляцией их числа и локализации и снизить таким образом вероятность модификации активных центров ферментов. Данные о сравнительной реакционной способности и относительному содержанию аминокислотных остатков приведены на рис. 13.. [c.84]

Аминогруппы белка наиболее часто используют для различного рода химических модификаций и для целей ковалентной иммобилизации ферментов. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, их в белке достаточно много (см. рис. 13). Во-вторых, аминогруппы высокореакционноспособны и уступают лишь 5Н-группам по числу и разнообразию реакций, в которых они могут принимать участие. В-третьих, в большинстве своем аминогруппы играют второстепенную роль в поддержании структуры и функции ферментов. Важное свойство аминогрупп — способность протонироваться (рК 9—10), обеспечивает в физиологических условиях наличие на поверхности белков положительных зарядов, которые взаимодействуют с противоионами из раствора или с отрицательно заряженными карбоксильными группами белка, образуя в последнем случае солевые мостики. Если для нормального функционирования фермента важно сохранение положительного заряда, то этого можно достичь при химической модификации аминогрупп, переводя их (алкилированием) из первичных во вторичные. В-четвер-ты , если некоторые аминогруппы, а не только их заряд, окажутся существенными для структуры и функции фермента, то их при необходимости нетрудно защитить, например, ацилированием ангидридом трифторуксусной кислоты или малеиновым ангидридом (первая из указанных защитных групп снимается в щелочной среде, а вторая — в кислой). В-пятых, для ковалентной иммобилизации ферментов посредством их аминогрупп разработано большое количество подходящих носителей и сшивающих реагентов. [c.85]

Как видно из схемы, помимо альдегидных и аминных групп в реакцию (18) вступают соединения с карбоксильной группой и изонитрилы с образованием амидной связи между белком и носителем. Иными словами, по методу Уги ферменты можно ковалентно иммобилизовать на носителях, содержащих альдегидные группы, в присутствии изоцианатов как по амино-, так и карбоксильным группам. Равным образом иммобилизация может быть осуществлена на носителях, содержащих изонитрильные группи-ров в присутствии низкомолекулярных альдегидов. [c.93]

Существующие способы ковалентной иммобилизации белков и ферментов на полистироле и его производных в основном разработаны для макропористых носителей и полистирольных гелей, используемых в ионообменной хроматографии. Сложность ковалентной Пришивки для целей ИФА состоит в том, что модификации должно подвергаться готовое штампованное изделие из оптически прозрачного непористого полистирола (или другого полимера). При этом оптические свойства носителя в процессе активации не должны ухудшаться, так как. На конечной стадии анализа Лунки планшета или пробйрка служат кюветой Для фотометриро-вания продукта ферментативной реакции. С другой стороны, условия модификации должны исключать изменение однородности поверхности носителя (Частичное растворение набухание полимера [c.206]

Для связывания с белком водорастворимый полимер должен иметь группы, способные взаимодействовать с функциональными группами белка в условиях, не вызывающих денатурацию последнего. В подавляющем большинстве случаев это реакции в водных растворах при pH = 6—8, реже 3—10. Химические методы при этом в основном те же, что применяются при иммобилизации ферментов [6], а также для связывания с полимером низкомолекулярных ФАВ. В белке для взаимодействия с полимером-носителем используют главным образом аминогруппы. Участие в реакции тиольных групп не всегда желательно, так как их в белках немного и они часто существенны для физиологической активности. Белок может быть предварительно обогащен тиольными группами, например обработкой Ы-ацетил-гомоцистеинтиолактоном, после чего его связывают с полимером. Карбоксильные и ароматические группы белка используются редко, так как в первом случае приходится активировать белок, после чего возникает возможность его сшивания, а во втором — нередко наблюдается снижение физиологической активности белка из-за изменения структуры его гидрофобных областей. [c.162]

Очистка сопровождается разрущением четвертичной структуры, гомогенный фермент из сердца голубя представлен мономером, не способным к ассоциации при повышении концентрации белка в растворе. Однако нельзя было полностью исключить возможности перехода мономера НАД-киназы в присутствии субстратов реакции в более ассоциированное состояние. Для решения поставленного вопроса провели иммобилизацию фермента и показали, что иммобилизованный мономер способен осуществлять синтез НАДФ. Последнее обстоятельство явилось доказательством гого, что мономер обладает каталитической активностью и, по-видимому, не способен в присутствии субстратов к ассоциации. [c.146]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология