Ферментные конъюгаты и субстраты

Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител Позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5— [c.111]

Ферментные конъюгаты и субстраты [c.361]

Наиболее широко распространенными ферментами, используемыми для конъюгации со вторичными антителами, являются пероксидаза хрена и ш елочная фосфатаза. Пероксидаза хрена - первый фермент, использованный для иммунологического выявления при иммуноблоттинге. Преимуш ествами данной системы является относительная дешевизна как ферментного конъюгата, так и субстратов, используемых для развития окраски. В то же время чувствительность данной системы ниже, чем у других, используемых в настояш ее время систем. К тому же окрашенные [c.67]

В качестве конъюгирующих агентов часто находят метильные группы. Метилирование заключается в переносе метильных групп от кофермента 8-аденозилметионина на амины, фенолы и тиоловые соединения с образованием М-, 0-, 8- метиловых конъюгатов, метильные группы на субстрат переносятся метилтрансферазами. Известно несколько ферментных систем, которые катализируют К-ме-тилирование природных и чужеродных аминов. [c.410]

Другой путь проведения ИФА в проточных реакторах основан на регистрации теплового эффекта реакции фермент — субстрат с помощью термистера. Определяемый экспериментально тепловой эффект зависит от количества связанного с иммуносорбентом ферментного конъюгата, которое в свою очередь зависит от начальной концентрации исследуемого соединения. На примере человеческого сывороточного альбумина с использованием его конъюгата с ката-лазой показана возможность определения белка в концентрации 0,1 мМ в течение 10 мин. [c.110]

Рис. 8-4. Турбидиметрический анализ многовалентных антигенов, основанный на активировании фермента. Многовалентный антиген из образца последовательно реагирует с антителами, меченными -галактозидазой, и модифицированными антителами, несущими большой отрицательный заряд (вследствие обработки янтарным ангидридом). В образующемся комплексе фермент окружен отрицательными зарядами. При анализе с помощью поликатиояного макромолекулярного субстрата (см. рис. 8-1) ферментный конъюгат, входящий в состав комплекса, проявляет большую активность по сравнению со свободным конъюгатом или конъюгатом, связанным только с антигеном, Аг — антиген, Ат — антитело, Ф — фермент

Важнейшим фактором, оказывающим непосредственное влияние на чувствительность анализа, является удельная активность ферментного конъюгата. Определив удельную активность в единицах количества субстрата, расщепляемого в единицу времени одним молем фермента в составе конъюгата, связанного с твердой фазой, можно сделать интересные расчеты. При проведении иммуноферментного анализа удобно работать в режиме, позволяющем получать приращение оптической плотности около 0,1 за 10 мин при конечном объеме реакционной смеси 1 мл. Это соответствует скорости изменения поглощения в диапазоне 0,01 опт. ед. в минуту. Для такого фермента, как щелочная фосфатаза, тестируемого по расщеплению п-нитрофе-нилфосфата, сформулированное требование соответствует при- [c.185]

ФСБ-Т), и разливают по 200 мкл в лунки илатА (каждому препарату сыворотки соответствует ряд лунок по вертикали) таким образом, чтобы каждая сыворотка тестировалась с восемью различными антигенами. Инкубируют I мин при 37 С. Затем удаляют растворы из лунок, заполняю/ их нагретым до 37 С раствором ФСБ-Т, инкубируют 5 мин Упри 37 °С, промывают 0,15%-ным раствором твина-20. В к дую лунку добавляют раствор ферментного конъюгата (на снове козьих антител против IgG человека, разведенный ФСБ-Т в 1500 раз) и инкубируют 15 мин при 37 С. Промывают так же, как и на предыдущей стадии, добавляя промывку водой, и затем обрабатывают раствором, содержащим Субстрат (0,03% Н2О2) и хромоген (0,1% о-фенилендиамина) на основе 0,07 М. ФСБ, pH 5,0. Реакцию останавливают добавлением 8 и. серной кислоты (50 мкл/лунку), контролируя время инкубации по развитию окраски в положительном и отрицательном контролях. При проведении рутинных диагностических тестов в качестве внутренних стандартов сравнения для всей мультиантигенной платы использовали амебные антигены. Измеряют поглощение при 492 нм. Содержимое лунок с оптической плотностью выше 2,0 разводят 1 5 раствором субстрата в смеси с кислотой и после этого снова измеряют А492- [c.370]

Конъюгат пепсина с растворимым сополимером этилена с малеиновым ангидридом оказался стабильным при хранении, несмотря на то, что белок был связан с полимером в 1—2 точках, в основном через е-аминогруппу единственного лизинового остатка [32]. К одной молекуле полимера, по-видимому, была присоединена только одна молекула фермента. При этом рН-профиль активности конъюгата был сдвинут на 1,5 ед. pH в щелочную область. Ферментативная активность конъюгата по отношению к высокомолекулярному субстрату (восстановленному молоку) была невелика — всего 8—14% от исходной в зависимости от pH, но термостабильность возросла в 2,5—5 раз. В то же время термостабильная кислая протеаза из РетсИИпит йиропЫ К 1014, связанная карбодиимидным методом с сополимером этилена с малеиновой кислотой (1 1), показала довольно высокую протеолитическую активность по отношению к казеину 34% от исходной при 30 °С и 70% при 75 °С. Следовательно, низкая активность полимер-ферментных конъюгатов, обусловленная стерическими препятствиями, не является их непременным свойством [33]. [c.172]

Готовят растворы двух препаратов инсулина в концентрации 100 мкг/мл и раститровывают в микропланшете для ИФА в концентрациях от 10 мкг до 5-10-5 мкг в лунку. Инкубируют в течение ночи при 4°С, тщательно отмывают. В лунки вносят раствор антител к свиному инсулину в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл. Инкубируют в течение часа при 37 °С, тщательно отмывают. Вносят конъюгат антимышиных антител с ферментной меткой и инкубируют в течение часа при 37 °С. Тщательно отмывают и вносят соответствующий субстрат (с. 319). Через 30 мин определяют величину оптической плотности при соответствующей длине волны (с. 320). Строят графики зависимости величины оптической плотности от разведения антигена. Полученные графики должны свидетельствовать о том, что специфичность связывания антител к свиному инсулину значительно выше по сравнению со связыванием бычьего инсулина, хотя в последнем случае и наблюдается специфическое связывание. Такой результат свидетельствует [c.327]

При создании комбинаторных библиотек вместо фага X можно использовать нитевидные бактериофаги М13 или fd (рис. 10.14). В этих случаях соответствующий фрагмент антитела синтезируется как часть химерного белка, локализованного на поверхности фаговой частицы. Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA). Суть метода состоит в следующем образцы (аликвоты) из библиотеки помещают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень. Ячейки промывают, чтобы удалить несвязанные фаговые частицы. В каждую ячейку вносят конъюгат, состоящий из антитела, связывающегося с белком фаговой оболочки, и фермента. Ячейки промывают для удаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом, связанным с фагом, и окраши- [c.219]

ЛИТЬ по образованию продуктов катализируемой им реакции. Большинство используемых ферментных меток способно за 1 мин при обычных температуре и давлении превращать в продукты 10 молекул субстрата в расчете на одну молекулу фермента. Каталитическая эффективность фермента сильно зависит от его трехмерной структуры (конформации), Пространственная структура фермента, как и любого белка, поддерживается многочисленными нековалентными взаимодействиями, такими, как гидрофобные и водородные связи, ионные контакты, а также ковалентными дисульфидными связями. Трехмерная структура фермента обеспечивает близкое соседство определенных аминокислотных остатков в положениях, наиболее выгодных для осуществления катализа. Нековалентные химические связи непрочны и легко разрушаются или ослабляются под влиянием тепловой энергии или дополнительных нековалентных взаимодействий, возникающих, например, при связывании ионов, хао-тропных агентов, детергентов, липидов и т. д. Известно, что присоединение к ферменту другой молекулы (скажем, аллосте-рического эффектора) в области, удаленной от активного центра (т. е. каталитического центра), может вызвать конформацион-ную перестройку, изменяющую пространственное расположение аминокислотных остатков в этом центре. Изменения в некова- лентных взаимодействиях, приводящие к новой, необычной конформации фермента, способны существенно повлиять на каталитическую активность. Подобная конформационная гибкость становится одной из помех при использовании фермента в качестве метки. Однако эта же гибкость полезна для разработки иммуноферментного анализа без разделения компонентов, основанного на вызываемых антителами изменениях в конформации конъюгата [лиганд — фермент]. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в их молекулах многочисленных функциональных групп (аминогрупп, сульфгидрильных, карбоксильных, карбамоильных, остатков тирозина), через которые можно ковалентно присоединять молекулы лигандов. [c.12]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология