Проведение ПЦР

Одной из разновидностей кассетного мутагенеза является способ введения мутаций, основанный на ПЦР с вырожденными праймерами. В этом случае при проведении ПЦР используют праймеры, которые получают введением в определенные положения при их синтезе разных нуклеотидов, что достигается применением на конкретных этапах синтеза не отдельных предшест- [c.323]

Генотипирование с использованием флуоресцентно меченных ПЦР-праймеров Колориметрическое генотипирование основано на применении ПЦР-праймеров, меченных различными флуоресцентными красителями. Чтобы различить мутантную ДНК и ДНК дикого типа, проводят ПЦР с двумя разными праймерами. Один из них (Р1) комплементарен ДНК дикого типа и на 5 -конце помечен родамином (красный цвет), другой (РЗ) комплементарен мутантной ДНК и на 5 -конце помечен флуо-ресцеином (зеленый цвет) (рис. 9.11). В обоих случаях амплификацию проводят в присутствии третьего, немеченного праймера (Р2), комплементарного противоположной цепи. Поскольку ПЦР может идти только в том случае, когда праймер полностью комплементарен ДНК-ми-шени, в присутствии в реакционной смеси всех трех праймеров будет амплифицироваться либо ДНК дикого типа, либо мутантная ДНК, либо обе они, в зависимости от ДНК-мишени, играющей роль матрицы. Если индивид гомозиготен по ДНК дикого типа, то после проведения ПЦР и удаления лишних праймеров будет наблюдаться флуоресценция красного цвета, если он гомозиготен по мутантной ДНК - зеленого, а если присутствуют и мутантная ДНК, и ДНК дикого [c.198]

Одноцепочечные олигонуклеотиды из -17-24 звеньев используют в качестве праймеров при секвенировании ДНК и проведении ПЦР. [c.86]

Чтобы иметь возможность провести молекулярно-генетический анализ ДНК, нужно прежде всего получить ее в чистом виде. Типичная диплоидная клетка человека в норме содержит около 6 пг геномной и разное количество митохондриальной ДНК. Тотальная ДНК, экстрагируемая из биологических образцов, представляет собой смесь ядерной и митохондриальной ДНК. Выделение ядерной ДНК возможно только через выделение и очистку клеточных ядер. Однако, как показывает практика, присутствие митохондриальной ДНК не мешает проведению ПЦР с использованием праймеров, специфичных для локусов ядерной ДНК, и наоборот. [c.71]

Для проведения ПЦР по ядерным локусам необходимо в среднем 1-10 нг ДНК. Таким образом, 1 мкл крови теоретически достаточно для проведения 46-ти амплификаций. [c.87]

Для проведения ПЦР по описанной в разделе схеме требуются следующие буферы и реактивы. [c.142]

Другим важнейшим компонентом реакционной смеси при проведении ПЦР является термостабильная ДНК-полимераза. В настоящее время, благодаря наличию высокоразвитой дилерской сети, имеется много источников разных термостабильных ДНК-полимераз, хотя, как это обычно бывает, первичных производителей этих ферментов намного меньше. Поэтому разнообразие доступных препаратов ферментов не так велико, как кажется на первый взгляд. [c.198]

Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом термостабильными ДНК-полимеразами при проведении ПЦР в оптимальных условиях [c.199]

Для проведения ПЦР в ее классическом варианте на разных цепях ДНК подбираются два места, расположенные относительно недалеко [c.38]

Один из ПЦР-тестов основан на выявлении фрагмента ДНК длиной 188 п. н., который присутствует во множестве копий в геноме Т. ruzi, но отсутствует в геномной ДНК нескольких родственных паразитов. После амплификации этот фрагмент без труда обнаруживается с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Незначительно варьируя методику проведения ПЦР (например, изменяя нуклеотидную последовательность праймеров), последнюю можно использовать для обнаружения широкого спектра бактерий, вирусов и паразитов. [c.190]

Для проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двунитчатой молекулы ДНК. При этом 3 -концы этих синтетических олигонуклеотидов должны быть направлены навстречу друг другу (рис. 1.31). [c.94]

Количества ДНК, выделенной из 1 мл крови, более чем достаточно для генотипирования методами ПЦР-анализа, и, как правило, можно ограничиться даже меньшим количеством биологического образца (табл. 1). ДНК, необходимая для проведения ПЦР-анализа, может быть выде- [c.39]

Для проведения ПЦР, РНКазного расщепления и ДГГЭ необходимы следующие предварительные процедуры. [c.141]

Реакции обычно проводят в 0,5- или 1,5-мл микроцентри-фужных пробирках Эппендорф (силиконировать их необязательно). Оборудование для нагрева и охлаждения может быть совсем простым и состоять всего лишь из набора водяных бань с различной температурой воды, или очень сложным и включать нагревательный блок, управляемый микропроцессором. Такой блок используется для полностью автоматизированной реакции амплификации. Условиям неавтоматического проведения ПЦР могут удовлетворять как водяные бани, так и масляные или воздушные нагревательные блоки. Водяные и масляные бани обеспечивают более быстрый теплообмен, чем воздушные нагревательные блоки, но не всегда обеспечивают требуемую чистоту работы. [c.178]

Термостабильная Гй(7-ДНК-полимераза в настоящее время широко применяется для проведения ПЦР (см. главу 6.1), а ее модифицированный (мутантный) аналог, для которого характерно многократное повышение сродства к терминирующим синтез ДНК дидезоксирибонуклеозидтрифосфатам, - для секвенирования ДНК по методу Сэнгера. [c.63]

Физическое разделение флуоресцентных красителей - репортера и тушителя флуоресценции - в процессе гидролитического разрушения зонда снимает подавление флуоресценции в анализируемой части спектра. Максимальный сигнал флуоресценции получают в том случае, если в зонде оба красителя максимально удалены друг от друга, т.е. находятся на 5 - и 3 -концах олигонуклеотида. Это вызвано, по-видимому, более эффективным расщеплением зонда ДНК-полимеразой [301]. Поскольку ДНК-полимераза может гидролизовать зонд лишь в составе гибрида с ДНК-матрицей, температура стадии элонгации праймера не должна превышать температуру плавления (Гд ) гибрида. Большинство используемых зондов обладают Tj 70°С, поэтому на практике при проведении ПЦР в реальном времени в системе TaqMan стадии отжига зонда и праймеров, а также элонгации объединяют и проводят при 60-62°С. Это приводит к тому, что ДНК-полимераза функционирует в субоптимальных условиях и делает всю систему TaqMan менее эффективной и гибкой по сравнению с системами ПЦР в реальном времени, основанными на других принципах (см. ниже). [c.226]

Праймер S1 и зонд гибридизуются с последовательностью, расположенной непосредственно перед делецией, и эта мутация не оказывает влияния на их взаимодействие с матричной ДНК. Место посадки праймера S2 удаляется делецией, и в этом случае соответствующий ПЦР-продукт не образуется в присутствии праймеров S1 и S2 в реакционной смеси, хотя реакция на мутантной матрице пройдет в присутствии праймеров S1 и S3, которые, в свою очередь, не функционируют на ДНК без делеции из-за слишком большого расстояния между этими праймерами. Таким образом, образование продукта ПЦР как в присутствии праймеров S1 + S2, так и S1 + S3 в реакционной смеси свидетельствует о наличии гетерозиготной делеции SEA в ДНК, как это представлено на рис. 24, б. Хотя теоретически эффективность образования продуктов ПЦР в присутствии обеих пар праймеров при наличии гетерозиготной делеции SEA должна быть идентичной, выявляемые с помощью ПЦР в реальном времени различия могут быть связаны с длинами ампликонов, поскольку все остальные условия проведения ПЦР в этих опытах были одними и теми же. С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемом примере позволяла обнаруживать 0,28 нг ( 20 копий) ДНК в пробе (рис. 24, в). [c.228]

Одним из ограничений проведения генетических исследований in vitro является малая доступность биологического материала. В частности, клетки дифференцированных тканей часто невозможно культивировать без утраты ими своего исходного фенотипа. Многие типы клеток, например сперматозоиды, вообще невозможно культивировать. Хотя с помощью известных праймеров можно амплифицировать отдельные участки генома, после проведения ПЦР остальной неамплифи-цированный генетический материал оказывается потерянным. В этой связи предпринимаются попытки разработки методов амплификации значительной части генетического материала на первом этапе его изучения с целью резервирования для дальнейшей работы. [c.239]

Пробы для проведения ПЦР включают ДНК-матрицу, 4с1ЫТР, Та -полимеразу. Реакционную смесь помещают в термальный циклиза-тор, где в разные периоды инкубации происходят повторяющиеся изменения температурного режима 55, 72 и 92 °С. Объясните, какую функцию выполняет выдерживание реакционной смеси при 92 °С. [c.94]

Ознакомьтесь с методом проведения ПЦР Выпищите принцип метода и схему выполнения экспериментальной работы, области применения этого метода в биологии и медицине. [c.362]

Видимо, здесь, в этом разделе, будет целесообразным упомянуть об относительно недорогом отечественном синтезаторе ДНК ASM-102U, выпускаемым ТОО БИОССЕТ (Новосибирск), который вполне способен обеспечить олигонуклеотидными праймерами для секвенирования ДНК и проведения ПЦР любую лабораторию. Однако в настоящее время весьма развит так называемый заказной синтез олигонуклеотидов, включая синтез модифицированных олигонуклеотидных праймеров, несущих какие-либо функциональные группы, что является дешевой альтернативой собственному синтезатору ДНК. Более подробную информацию о синтезаторе ДНК ASM-102U, а также о фирмах, занятых в заказном синтезе олигонуклеотидов, заинтересованный читатель может найти в разделе Отечественные поставщики материалов и оборудования для секвенирования ДНК. [c.77]

Другим способом амплификации и последующего секвенирования неизвестных участков ДНК, прилегающих к известным, является подход с проведением ПЦР с пониженной температурой отжига (например, 40 °С вместо 55 °С) в первых циклах с тем, чтобы используемый праймер мог отжечься еще в других участках ДНК [Malo et al., 1994]. Более [c.285]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК in vitro. В течение нескольких часов можно размножить определённую последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в миллион раз и более. Следовательно, исходно требуется очень незначительное количество материала. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемого фрагмента или по крайней мере этого фрагмента. [c.262]

В литературе имеется чуть ли не единственное сообгцение об успешной амплификации относительно короткого фрагмента ДНК из останков динозавра, жившего приблизительно 80 млн лет назад в период позднего мела. Причем из осугцествленных в ходе выполнения той работы почти 3000 попыток проведения ПЦР, удались только 9, в которых оказались амплифицированы участки митохондриальной ДНК длиной по 174 пн. Определение нуклеотидных последовательностей этих участков и их сравнение с аналогичными областями митохондриального генома других видов животных показало, что организм, которому они принадлежали, на эволюционной лестнице теоретически должен занимать место где-то между рептилиями и млекопитаюгцими, подтвердив тем самым, что это действительно настоягцая ДНК [c.36]

Смотреть страницы где упоминается термин Проведение ПЦР: [c.99] [c.557] [c.78] [c.192] [c.197] [c.206] [c.211] [c.212] [c.235] [c.237] [c.352] [c.400] [c.121] [c.149] [c.151] [c.49] [c.328] [c.32] [c.34] [c.36] [c.39] [c.40]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология