Агаровая пластинка

Фиг. 26. Приготовление агаровой пластинки для иммуноэлектрофореза (макрометод).

Приготовление агаровых пластинок и проведение электрофореза. [c.93]

Для приготовления агаровых пластинок используют предметные стекла. Предварительно их обезжиривают, тщательно промывают водой и высушивают. Стекла нумеруют, укладывают на строго горизонтальную поверхность и на каждое осторожно наливают пипеткой с широким концом 4 мл агара. Пузырьки воздуха в агаре необходимо вывести пипеткой на края стекла. Когда агар застынет и образуется твердый гель, в нем посередине вырезают лунку (щель) для нанесения исследуемого раствора. Приготовленные пластинки укладывают в электрофоретическую камеру. Агаровое плато соединяют с буферным раствором бумажными мостиками из фильтровальной бумаги. В щель каждой пластинки вводят сыворотку крови, предварительно разведенную буферным раствором. На электрофореграмму наносят около 100—300 мкг белка в объеме 0,01 мл. Прибор подключают к источнику тока. Медленно повышая напряжение, доводят силу тока до 20—25 мА (напряжение 200—300 В). Электрофорез проводят в течение 3—4 ч. [c.93]

Обработка агаровых пластинок. После окончания электрофореза ток выключают, предметные стекла с агаровым гелем тотчас извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5%-ный раствор СНзСООН. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-ном растворе СНзСООН, для удаления воды и солей и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его проводят при температуре 37 °С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агаровой пленке, осторожно снимают, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агаровое поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 °С. [c.93]

Отмывающий раствор смешивают 830 мл дистиллированной воды, 20 мл уксусной кислоты и 150 мл глицерина. После окрашивания в течение 5 ч агаровые пластинки отмывают, меняя каждые 20 мин отмывающий раствор, пока не содержащие белка участки агара не освободятся от красителя. [c.76]

Во время окрашивания слой агара отклеивается от стекла. После того как отделившиеся агаровые пластинки окрасятся, их помещают на стекло и высушивают при комнатной температуре. [c.76]

Отмывающий раствор 50%-ный этанол. После окрашивания в течение 2 ч агаровые пластинки отмывают, дважды погружая на 15 мин в отмывающий раствор. Если окрашенный препарат поме- [c.76]

Количественное определение белков при электрофорезе в агаре. Процентное содержание полученных фракций можно определить фотоэлектрическим методом. Отделенная от стекла и высушенная агаровая пластинка достаточно прозрачна, поэтому ее без дополнительной обработки помещают между стеклянными пластинками денситометра и проводят измерение оптической плотности, как описано на стр. 63. [c.77]

Миграция белков в слое агарового геля подобна их движению при свободном электрофорезе. Однако в агаровом геле значительно сильнее, чем при электрофорезе на бумаге, выражен электроосмос, который усиливает поток буферного раствора в сторону катода. Чтобы устранить возможные артефакты, следует размещать лунки для внесения исследуемого образца точно в центре агаровой пластинки. [c.77]

Кроме описанного фиксатора, при окрашивании липопротеидов можно применять также фиксирующий раствор следующего состава [291 смесь 500 мл этанола, 20 мл 10%-ного раствора СаСЬ и 20 мл уксусной кислоты, объем которой доводят до 1000 мл дистиллированной водой. Агаровые пластинки помещают в этот фиксатор на 6 ч. [c.77]

В зависимости от количества анализируемых образцов число и схема расположения лунок в агаровой пластинке могут варьировать. На фиг. 25 представлено несколько часто используемых схем [c.134]

А. Непосредственная фотопечать с агаровой пластинки. После образования полос преципитации поверхность агарового геля промывают дистиллированной водой и помещают препарат, подобно негативной фотопластинке, в фотоувеличитель. Далее поступают точно так же, как при обычной фотопечати. При помощи объектива фотоувеличителя полосы преципитации фокусируют на светочувствительной бумаге. Рекомендуется печатать на контрастной фотобумаге и использовать контрастный проявитель. [c.135]

Б. Окраш.ивание полос преципитации. Окрашивание агаровых пластинок не только делает полосы преципитации более заметными, но и повышает точность анализа за счет дополнения его специфическими цветными реакциями. Специальные методы окрашивания позволяют, кроме того, более подробно изучать белки и липопротеиды. [c.135]

Электрофорез. После внесения исследуемых образцов агаровые пластинки помещают в камеру прибора для электрофореза. Контакт агарового геля с буферными ваннами прибора осуществляется с помощью полосок фильтровальной бумаги, смоченных буферным раствором. Бумажные фитили должны примерно на 15 мм покрывать гель на обоих концах агаровой пластинки. [c.142]

После элюирования агаровый гель сверху покрывают листом фильтровальной бумаги соответствующего размера, смоченным дистиллированной водой, и высушивают в термостате при 37°С. После полного высушивания агаровой пластинки покрывающую ее фильтровальную бумагу отклеивают, смочив несколькими каплями дистиллированной воды, и затем окрашивают сухую пленку агара в той же чашке Петри, в которой была поставлена реакция. [c.135]

Перед окрашиванием агаровые пластинки обрабатывают 10 мин 10%-ной уксусной кислотой. [c.136]

После 30 мин окрашивания окрашивающий раствор сливают и агаровую пластинку заливают дифференцирующим раствором. Затем препарат обрабатывают отмывающим раствором, меняя его каждые 15 мин, пока не прекратится элюирование красителя. [c.136]

Готовую агаровую пластинку закрепляют в приборе для электрофореза и покрытые гелем фитили фильтровальной бумаги погружают в буферный раствор, заполняющий ванны. [c.139]

Описаи также метод, который в принципе представляет собой обратную модификацию методики, упомянутой выше [5]. Сначала готовят агаровую пластинку, в которой затем вырезают полоски геля и, удалив их, освободившееся место заполняют суспензией сефадекса. После этого проводят гель-фильтрацию в образованных таким образом слоях сефадекса. Дальнейшие этапы те же, что и при иммуноэлектрофорезе. [c.241]

ТОЧНЫХ белков — 0,2 мл сыворотки крови), подогревают до 40°С и смешивают с 0,8 млЗ%-ного расплавленного агара, приготовленного на дистиллированной воде и охлажденного до 40°С. Полученную смесь вносят в лунку для исследуемого образца на агаровой пластинке. Оставшийся свободный объем лунки заполняют 1,5%-ным агаровым гелем в буферном растворе. При заполнении лунки следует избегать образования пузырьков воздуха. [c.139]

После этого агаровую пластинку помещают во влажную камеру и оставляют до образования полос преципитации, которые появляются в геле через 2—5 дней. [c.140]

Между двумя буферными ваннами располагается камера для закрепления агаровых пластинок, также изготовленная из плексигласа. По ее верхнему краю с двух сторон внутри есть выступ шириной 2 мм, на который укладывают предметные стекла с агаровым гелем. Расстояние между краями выступа составляет 76 мм. Камера для агаровых пластинок закрывается плексигласовой крышкой, которая защищает агар от высыхания во время электрофореза. В каждый отсек ванны наливают по 150 мл буферного [c.140]

Приготовление слоя агарового геля. Сухие предметные стекла помещают на горизонтальную поверхность (см. стр. 138) и с помощью пипетки с достаточно широким выходным отверстием наливают на поверхность каждого стекла 2 мл 1,5%-ного расплавленного агара, приготовленного на буферном растворе (об очистке агара и приготовлении геля см. на стр. 127). Необходимо добиться того, чтобы слой агарового геля был равномерным, покрывал всю поверхность стекла и не содержал пузырьков воздуха. Как только агар затвердеет, пластинки переносят во влажную камеру и хранят в холодильнике. Чаще всего агаровые пластинки готовят за 24 ч до постановки опыта. [c.142]

Камеру с агаровыми пластинками закрывают крышкой и включают ток. Если напряжение, измеренное на краях агаровой пластинки, достигает 45 В, то электрофоретическое разделение белков закончится уже через 45—60 мин. [c.142]

Методика. Высушенную агаровую пластинку на 15 мин погружают в раствор I, затем 15 мин отмывают дистиллированной водой и окрашивают раствором II до появления легкого фиолетового оттенка. После этого препарат 10 мин промывают проточной водопроводной водой и высушивают при 37°С. [c.145]

Методика. Высушенную агаровую пластинку 20 мин окрашивают в растворе I, а затем 30 мин отмывают в растворе И. [c.145]

После 15 мин окрашивания агаровую пластинку отмывают дистиллированной водой. [c.146]

Приготовление агаровой пластинки см. стр. 142. [c.149]

В середине агаровой пластинки вырезают лунку для внесения исследуемого образца, а на расстоянии 3 мм от лунки, по обе стороны от нее, делают две параллельные канавки. [c.149]

Примерно в середине агаровой пластинки вырезают две круглых лунки диаметром около 5 мм на расстоянии 2—3 см одну от другой. Лунка, расположенная ближе к катоду, предназначена для раствора антигена, а лунка, расположенная в анодной части геля,— для иммунной сыворотки. Непосредственно перед заполнением лунок в каждую из них вносят несколько капель расплавленного агара. [c.154]

Титрование антигена. В центральную лунку заливают 0,2 мл иммунной сыворотки, агаровую пластинку помещают во влажную камеру и оставляют при 37°С на 24—72 ч. В результате диффузии иммунной сыворотки от центральной лунки по направлению к периферическим возникает градиент концентрации антител. [c.158]

Заполнение лунок. Часть лунок в агаровом геле заполняют капиллярной пипеткой заранее приготовленными растворами белка известной концентрации в соответствующих разведениях. В оставшиеся лунки наливают исследуемые образцы белковых смесей, например сыворотки крови. Следует тщательно следить за тем, чтобы во всех лунках был налит одинаковый объем растворов, заполняющий их точно до краев. После этого агаровую пластинку помещают во влажную камеру и на 24 ч оставляют в холодильнике. [c.159]

Arap — 1%-ный раствор. Агар должен быть чистым и прозрачным. Для его очистки из коммерческого препарата готовят 2%-ный раствор на дистиллированной воде. Горячий раствор разливают в ванночки слоем толщиной в 1—1,5 см. После застывания агаровую пластинку разрезают на кубики, помещают их в толстостенный стакан и промывают в течение двух суток под струей водопроводной воды, затем в течение суток — дистиллированной водой, сменив ее 4—5 раз. Агар обсушивают фильтровальной бумагой, помещают в колбу, разогревают, горячий раствор разводят в 2 раза буферным раствором и трижды фильтруют через 3 слоя марли. Раствор агара хранят в холодильнике. Перед нанесением на пластинки его нагревают на кипящей водяной бане, пока он не станет свободным от пузырьков воздуха. [c.93]

Если даже кратковременно экспонировать агаровую пластинку на открытом воздухе, то можно увидеть рост на ней микробных колоний, в том числе многих желтых, оранжевых и красных бактерий и дрожжей. Пигменты, обусловливающие их окраску, во многих случаях являются каротииоидами. И, хотя распространение каротиноидов у бактерий систематически не изучалось, все же можно сделать некоторые обобщения. [c.55]

Приготовление агаровой пластинки. Обычно реакцию ставят в плоском слое агарового геля, затвердевшего на дне чашки Петри. Сначала внутреннюю поверхность чашки Петри покрывают агаровой пленкой. Для этого ее наполняют 0,1 %-ным расплавленным агаром, затем сразу же агар выливают, а чашки переносят в эксикатор для полного высушивания. Другой вариант подобной процедуры состоит в том, что покрывают дно чашки Петри слоем 1%-ного расплавленного агара толщиной примерно 1 мм. В качестве консерванта в агар следует добавить мертиолат. [c.131]

Перед окрашиванием на высушенную агаровую пластинку наливают 10%-ную уксусную кислоту и оставляют ее на 10 мин. Затем уксусную кислоту сливают и на 60 мин заливают препарат раствором амидового черного. После этого краситель сливают, а избыток его удаляют отмывающим раствором, меняя этот раствор каждые 15 мин, пока он не будет оставаться бесцвет-ным. [c.136]

Делая с помощ,ью штампа на одной агаровой пластинке две лунки для внесения образца, мы получаем возможность одновременно анализировать два разных белка или две разных белковых смеси и сопоставлять их иммуноэлектрофоретические характеристики. Это имеет особое значение при анализе белков сыворотки крови, при котором в одну из лунок помеш,ают исследуемую сыворотку, а в другую — нормальную сыворотку. В этих условиях [c.143]

Принцип метода. Если после иммуноэлектрофореза исследуемой смеси белков в одну из параллельных канавок агаровой пластинки ввести раствор известного белка, а в другую — специфическую антисыворотку к этому белку, то в месте встречи диффундирующих антигенов и антител образуется продольная полоса преципитации. Если исследуемая смесь белков содержит компонент, идентичный известному белку, то соответствующая этому компоненту полоса преципитации по краям сольется с продольной полосой, демонстрируя феномен идентичности по Ухтерлони (см. стр. 131). [c.149]

Приготовление агаровой пластинки. На стеклянную пластинку размером 10 х 16 см наносят 40 мл расплавленного 1,5%-ного агара в вероналовом буферном растворе pH 8,2. Затвердевший слой агарового геля разрезают в продольном направлении таким образом, чтобы после удаления лишних участков геля на стекле осталась только полоска шириной 15 мм. Со стороны катода на расстоянии одной трети длины этой полоски геля и на равном расстоянии от ее краев делают лунку для внесения исследуемого образца [c.151]

Приготовление агаровой пластинки, содержащей антитела. Готовят 3%-ный агар на 0,03 М калий-фосфатном буферном растворе pH 8,0, содержащем 0,1 М ЫаС1, и помещают его в водяную баню при 56°С. Соответствующую моноспецифическую антисыворотку разбавляют в зависимости от титра фосфатным буферным раствором (см. примечание 2) и нагревают также до 56 С. 8 мл нагретого 3%-ного агара и 8 мл подогретой антисыворотки смешивают при 56°С и 15 мл смеси наливают на стеклянную пластинку размером 8 X 10 см, расположенную на горизонтальной поверхности. После затвердения агара пластинку помещают во влажную 1<амеру и хранят в холодильнике до использования. (Рекомендуется к смеси агара и антисыворотки добавлять мертиолат в разведении 1 [c.159]

Модифицированный метод Илека. К 2,5 мл расплавленной и остуженной до 45 °С основы среды Илека добавляют 0,5 мл стерильной телячьей сыворотки, тщательно перемешивают и выливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 45 мм. После застывания агара на его поверхность бляшками засевают испытуемые и контрольные (заведомо токсигенные) культуры коринебактерий. В центр чашки (на расстоянии 9 мм от краев бляшек) на поверхность агара помещают бумажный диск, пропитанный противодифтерийной антитоксической сывороткой (10 МЕ) в другом варианте ту же сыворотку (4,5 МЕ) вносят в лунку, вырезанную в центре агаровой пластинки. После инкубирования при 37 °С в течение 24 —48 ч в агаре между бляшками токсигенных коринебактерий и диском (лункой) отмечают появление тонких линий преципитата (см. рис. 1.26). [c.203]

Плотные питательные среды перед использованием прогревают, чтобы перевести в жидкое состояние, стерильно разливают в предварительно простерилизованные чашки Петри и дают гелю застыть. Затем набирают в стерильную липетку определенное количество исследуемой воды (например, 0,1 мл) выливают ее на поверхность агаровой пластинки и равномерно распределяют по поверхности стерильной изогнутой стеклянной палочкой (шпателем). [c.164]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология