Белки связывание красителя

В действительности же такое усиление, как мы видели, возможно только за счет неспецифического связывания красителя карбоксильными группами белка в слабокислой и особенно в нейтральной среде, что, видимо, и имело место в опытах упомянутых авторов. [c.150]

Таким образом, при работе с основными красителями источниками ошибок количественной цитохимии могут быть 1) неполнота извлекаемости НК экстрагентами и неполнота удаления РНК рибонуклеазой при выявлении неспецифического связывания красителя 2) недоступность части НК красителям вследствие блокирования их фосфатных групп аминогруппами белка или вследствие упаковки молекул НК белками и белково-липид-ными структурами (РНК в рибосомах, РНК и ДНК в компактном хроматине и т, д.) 3) неудачный подбор pH раствора красителя 4) неполная фиксация. [c.151]

По данным А. Дейч [И], количество связанного с НК метиленового голубого не зависит от концентрации красителя и продолжительности окраски в диапазоне pH 3,75—4,25. Белки, особенно гистоны и основные негистоновые белки, мешают связыванию красителя. [c.159]

Для того чтобы освободить фосфатные группы НК от белков, препарат обрабатывают уксусным ангидридом при 45 или 60° в течение 4 часов. При этом ацетилируют аминогруппы лизина и аргинина и достигают максимального связывания красителя. Идеальным является одновременное блокирование карбоксильных групп белка, которые в слабокислой среде могут конкурировать за краситель. [c.159]

Неспецифическое связывание красителя учитывается в параллельных препаратах, обработанных сначала хлорамином Т или уксусным ангидридом, затем РНК-азой. Неспецифическое связывание красителя после обработки хлорамином Т и уксусным ангидридом обусловлено двумя факторами. Во-первых, наличием в протоплазме свободных кислых групп белков и полисахаридов, во-вторых, некоторым смещением ИЭТ белка в кислую сторону за счет блокирования или удаления аминогрупп. [c.169]

Рассматривая химические изменения, следует ожидать, что поверхностные свойства белков могут изменяться при облучении в растворе. В согласии с этим емкость белков к связыванию красителей и неорганических ионов при облучении изменяется [В25, В54]. Изменяется также хроматографическое поведение [Н23]. Можно было также ожидать изменения электрофоретического поведения, а электрофоретические свойства могут явиться очень чувствительным признаком повреждения [С 138]. Зарегистрированы изменения в электрофоретических свойствах каталазы [В21]. Существует одно исследование, которое показало, что очищенные белки, по-видимому, не изменяют электрофоретического поведения в то же время смеси белков дают продукт со свойствами, отличными от исходных [К24]. При интерпретации изменений этого типа следует быть осторожным. Хотя химические и структурные изменения должны играть большую роль, при полном объяснении результатов следует принимать во внимание изменения в устойчивости неорганических коллоидов, происходящие при облучении. Найдено вообще, что положительно заряженные коллоиды коагулируют и их устойчивость уменьшается, в то время как отрицательно заряженные коллоиды изменяются слабо [НЗ]. К сожалению, радиационная химия коллоидов в настоящее время мало понятна. [c.257]

Денситометрия. Для обнаружения белков в геле часто используют краситель кумасси, однако при высоких концентрациях белка наблюдаются отклонения от закона Бэра. Зависимость оптической плотности от концентрации линейна при концентрациях белка 1—50 мкг влияют тип белка, размеры геля и длина электрофоретического пробега зоны. Денситометрия окрашенных зон невозможна, если зоны сильно отличаются по содержанию белка. Способность связывать молекулы красителя сильно варьирует у различных белков. Полагают, что связывание красителя основано на электростатическом взаимодействии между молекулой красителя и основными группами белка (т. е. основные белки окрашиваются более интенсивно по сравнению с кислыми), однако, вполне возможно, имеет место и гидрофобное взаимодействие. Вследствие этого необходимо определять связывающую способность каждого исследуемого белка. [c.62]

Неспецифическое связывание красителя. Ряд красителей был использован для определения белка по окраске, возникающей в результате простой адсорбции. Некоторые из них дают воспроизводимые результаты (в данных условиях) и достаточно высокую чувствительность, но степень связывания красителя зависит от индивидуальных свойств белка. Кроме того, зависимость степени сорбции от концентрации белка не линейна и у разных белков угол наклона кривой сильно различается. [c.292]

Это быстрый и удобный метод измерения концентрации растворенных белков, основанный на количественном связывании белков с красителем. Он не применим для измерения белка в рассеивающих образцах. Хотя число соединений, мешающих определению белка этим методом сравнительно невелико, краситель реагирует более или менее сильно с различными очищенными белками. Поэтому определение концентрации различных по составу белков этим методом лишь до некоторой степени количественное. К преимуществам метода можно отнести быстроту определения (10 мин) и высокую чувствительность. К недостаткам — варьирование результатов при определении концентраций различных белков и необратимое денатурирование порции белка, пошедшей на определение. [c.140]

Поскольку ферментные белки по реакциям связывания красителей практически не отличаются друг от друга, в основе гистохимии ферментов лежит выявление продукта ферментативной реакции. Специфическое выявление ферментного белка может быть проведено лишь с помощью сложных иммуногистохимических методов (см. стр. 297) При этом следует обращать внимание на то, что гистохимические методы не могут дать сведений о том, в каком состоянии находится фермент—в активном или неактивном. [c.172]

Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера геля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно менее прочно, чем с белками, поэтому от фона удается без особого труда избавиться отмывкой геля, например вымачиванием его в относительно большом объеме растворителя с не- [c.88]

Окрашенный гель из трубки можно сканировать в специальном приборе или с помощью приставки, которой комплектуются сейчас многие продажные спектрофотометры. Не следует, впрочем, слишком полагаться на соотношение размеров пиков такой электрофореграммы при оценке количественного соотношения белков в полосах, так как связывание красителя зависит не только от концентрации, но и от химического состава и конформации белка. [c.92]

Метод основан на связывании с белками одного из кислых красителей кумасси синего, выпускаемого в двух модификациях R-25Q и G-250. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется интенсивности окраски от концентрации белка в пробе и диапазоне 1—10 мкг/мл имеет линейную зависимость. [c.83]

Одним из важных следствий гидрофобных взаимодействий, приводящих к образованию гидрофобной области (ядра) или областей в структуре белка, является связывание белками малых молекул неполярного характера. Как будет показано в дальнейшем, гидрофобные области являются местами связывания различных неполярных молекул углеводородов, красителей, жирных спиртов, кислот и других ПАВ. [c.19]

Белковые (коллоидные) ошибки. Специфические химические реакции между растворенным веществом (как, например, ионами тяжелых металлов) и индикатором могут привести к заметным ошибкам при определении pH. Влияние, оказываемое белками и коллоидами на результаты измерений pH с помощью индикаторов, обусловлено амфотерностью белковых молекул или зарядом коллоидных частиц. Вероятно, связывание индикаторных красителей сильно зависит от заряда белка оно является наименьшим вблизи изоэлектрической точки. Кларк [9, стр. 185, 186] приводит для некоторых индикаторов значения белковой ошибки, выраженной в единицах pH. [c.152]

Чем дальше pH раствора красителя сдвинут в щелочную сторону, тем больше белков участвует в связывании основных красителей, тем менее специфичной в отношении НК становится адсорбция этих красителей. Наоборот, с уменьшением pH раствора адсорбция основных красителей становится более специфичной. [c.150]

Связывание с красителем 30 мг/л Детергенты Реакция не так сильно зависит от состава белка, как в методе Лоури быстрота Использование фосфорной кислоты [78, 95, 101] [c.347]

Особенностью этих соединений является значительное изменение спектров поглощения или флуоресценции при связывании с ферментом. Этот спектральный сдвиг трактовался [25671 как следствие изменения диэлектрической проницаемости среды при комплексообразовании красителя с белком, причем свойства активного центра химотрипсина в этом отношении близки к свойствам циклогек-сана. Однако спектральный сдвиг красителя, по-видимому, определяется не столько диэлектрической проницаемостью, сколько" показателем преломления среды [2568]. [c.242]

Способ связывания красителя с волокном изменяется в зависимости от характера волокна. Животные волокна, состоящие из белков, содержат кислотные и основные группы в боковых цепях полипептидной цепи. Поэтому эти волокна красят основными или кислотными красителями, связывающимися с волокном за счет образования солей. На практике для крашения шерсти применяют исключительно кислотные красители (содержащие группы SO3H) крашение производится из кислого раствора, содержащего сернокислый натрий, способствующий равномерному распределению красителя на волокне. [c.475]

Органические анионы и катионы соединяются с белком при помощи такого же типа электровалентной связи. Определенные методические преимущества представляет изучение соединения белков с окрашенными ионами. Если соединение с неокрашенными ионами может быть исследовано лишь при помощи очень трудоемких аналитических методов, то соединение белков с красителями можно изучать спектроскопически, так как процесс связывания ионов красителя сопровождается изменением окраски и спектра поглощения. Этим путем было количественно изучено соединение белков с метиловым оранжевым и другими подобными красителями [8, 9], а также с нитрофенолами [10]. Диали-зируя сывороточный альбумин против метилового оранжевого, удалось установить, что наибольшее число молекул красителя, связываемых одной молекулой белка, равно 22. Метиловый оранжевый является кислым азокрасигелем [c.221]

В качестве реагентов для этерификации карбоксильных групп белка в водном растворе при комнатной температуре были исследованы также окиси. Френкель-Конрат [42] нашел, что при контакте в течение нескольких дней окиси этилена, окиси пропилена и эпихлоргидрина с рядом белков получаются менее растворимые белковые производные с изоэлектрической точкой, смещенной в щелочную сторону на 3 единицы рН. Эти факты наряду с результатами электрофоретических измерений и данными, полученными при определении количества амфотерных групп методом связывания красителей, свидетельствуют о том, что большая часть карбоксильных групп подвергается этерификации, но что основность аминогрупп при этом не изменяется. Однако эта реакция оказалась неспецифичной. Фенольные и сульфгидрильные группы также взаимодействуют с окисями с образованием соответственно простых эфиров и тиоэфиров. Аминогруппы лучше всего алкилируются при рН 8, образуя вторичные амины с неизмененной основностью, которая таким образом характеризует физические свойства избирательно этерифици-рованных белков. Реакция проводилась в нейтральных, кислых и щелочных растворах и в растворах мочевины, причем доля различных вступающих в реакцию функциональных групп до некоторой степени зависела от условий проведения реакции. Можно предположить, что протекают следующие четыре реакции [c.299]

Полученные производные охарактеризовывали по привесу продуктов после тщательных экстракций, анализом на содержание хлора образцов, полученных при взаимодействии с о-хлорфенилизоцианатом, а также понижением гидрофильности кроме того, проводили исчерпывающий анализ белка на содержание функциональных групп с целью установления степени замещения исследовали также связывание модифицированным белком разных красителей для определения общего числа кислых и основных групп. Опыты, проведенные на модельных соединениях, также подтвердили предполагаемые направления реакции изоцианатов с определенными функциональными группами белков. Так, было показано, что изоцианаты реагировали с основными группами (амино- и гуа-нидиногруппами и имидазольным циклом), группами кислого характера (меркаптанной, фенольной гидроксильной и карбоксильной группами), первичными амидными группами и, вероятно, частично с алифатическими гидроксильными группами. [c.369]

Из используемых красителей (флуорохромов) наиболее интенсивной флуоресценцией и стабильностью отличается изотиоцианат флуоресцеина. Дансил быстрее и легче связывается с белками. Использование диахромов для данного метода еще требует доработки. Высокая стабильность конъюгатов обеспечивается связыванием красителей с белками за счет главных валентностей. [c.298]

После электрофореза в присутствии ДДС-Ыа гель окрашивают, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ К-250 (см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и добавкой ионообменника АО 501x8 для связывания красителя. Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Однако следует иметь в виду, что ДДС-Ыа является эффективным детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и фиксации белков. Д я малых белков фиксация при окрашивании может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать предварительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кисло-,те (ТХУ). ДДС-Ыа, находясь в комплексе с белком, еще и препятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания. 10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Ыа. Еще лучше это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Ыа, поэтому его целесообразно включить в фиксирующий белки раствор. [c.64]

Теперь мы опишем несколько доступных методов определения белка. Некоторые из них, требующие специальной аппаратуры (определение азота по Кьельдалю, рефрактометрия), исключены из рассмотрения. К наиболее широко применяемым методам относятся 1) биуретовая реакция с использованием щелочного pj TBopa соли меди 2) метод Лоури с применением реактива Лоури—Фолина—Чиокалто 3) измерение оптической плотности в УФ-области спектра при 280 нм (полоса поглощения ароматических групп) или при 205—220 нм (полоса поглощения пептидных групп) 4) связывание красителей. [c.310]

В этом разделе мы не намереваемся описывать все методические подробности, а хотим лишь обрисовать основные особенности используемых процедур. После проведения электрофореза зоны белков должны быть визуализированы. Этой цели служит процедура окращивания, в которой обычно используетс какой-нибудь органический краситель, прочно связывающийся с белками. Существует много пригодных для этого красителей. Они должны удовлетворять следующим требованиям 1) обладать высокой чувствительностью, позволяющей определять малые количества белка и 2) интенсивность окраски должна быть, пропорциональна количеству белка независимо от его типа. Большинство используемых красителей притягивается к положительно заряженным группам в молекулах белков (к остаткам лизина и аргинина) следовательно, белки с более высоким содержанием таких групп — обычно это более основные белки — окрашиваются сильнее. В результате некоторые кислые полипептиды могут остаться незамеченными из-за слиш1сом слабого связывания красителя. [c.325]

Основан на адсорбции красителя Кумасси ярко синий G-250. При связывании красителя с белком развивается ярко-синяя окраска (Bradford, 1976). Поглощение измеряют при 595 нм. [c.48]

Недавно Хьюз и соавторы обнаружили, что связыванию некоторых белков на проционовых красителях весьма способствуют небольшие концентрации ионов переходных металлов (Zn " , Со " , Мп " , и Си ). Для некоторых белков этот эффект высокоспецифичен в отношении как иона, так и красителя для других — связывание стимулируется целым рядом ионов. Элюцию иногда удается вести хе-лирующим агентом [Hughes et al., 19821. Наконец, известно, что триазиновые красители, в частности iba ron Blue , обнаруживают сродство к целому ряду весьма различных ферментов, которые объединяет только то обстоятельство, что они взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами. [c.368]

Например, А. Д. Браун, В. Л. Немчинская и 3. Б. Попова [2] наблюдали усиление связывания основных красителей РНК в присутствии белка. Они отнесли это за счет изменения конфигурации молекулы самой НК. [c.150]

Другой метод исследования заключается в использовании оптически неактивных катионных красителей, при связывании которых со спиралью поли-Ь-глутаминовой кислоты появляется сильный эффект Коттона. При этом кривая дисперсии пересекает линию нулевого вращения вблизи полосы поглощения красителя (фиг. I). Для поли-О-глутаминовой кислоты также можно получить подобный, но противоположный по знаку, эффект Коттона, который исчезает при переходе от спирали к хаотической конформации, несмотря на то что краситель остается связанным с макромолекулой. Белки, в состав которых входят гемогруппы, содержащие железо (миоглобин, гемоглобин, ката-лаза, пероксидаза), обладают своим собственным красителем , и в их спектрах наблюдается эффект Коттона в видимой области, т. е. в области поглощения гема. При денатурации этот эффект исчезает, но поглощение в видимой области при этом сохраняется. При добавлении оптически неактивного восстановленного никотинадениндинуклеотида к алкогольдегидрогеназе из печени (ферменту, содержащему цинк) наблюдается эффект Коттона в области поглощения нуклеотида. Однако в этом случае эффект Коттона обусловлен, по-видимому, асимметрией связывающей поверхности фермента, а не асимметрией спирали. Аналогичным примером могут служить комплексы оптически активных аминокислот (не поглощающих видимого света) с медью. В полосе поглощения медных комплексов, уже находящейся в видимой области, наблюдается эффект Коттона, индуцируемый аминокислотами. [c.294]

Фермент ксантозин-5 -фосфатаминаза иллюстрирует некоторые стороны механизма регуляции, которые могут отражать связывание на центре, отличном от активного центра. Этот фермент подвергается неконкурентному ингибированию антибиотиком псикофуранином, который структурно связан с регуляторными метаболитами этой системы. Так же как в случае многих ферментов подобного рода, ингибиторная активность может быть утрачена при добавлении веществ, которые, как можно ожидать, изменяют структуру белка, например мочевины или сульфгидрильных реагентов, или при фотоокислении в присутствии красителя метиленового голубого. Это происходит без нарушения каталитической активности фермента и указывает, что центр ингибирования отличается от каталитического центра. Взаимодействие фермента с меркаптоэтанолом приводит к частичному понижению чувствительности к ингибированию, хотя фермент продолжает связывать ингибитор. Это является дальнейшим подтверждением того, что в интактном белке существует область между каталитическим и регуляторным центрами, через [c.250]

Часто обнаруживают, что большие ионы сильно взаимодействуют между собой в водном растворе, в то время как ионы меньших размеров с теми же заряженными группами взаимодействуют слабее или вообще не взаимодействуют. Взаимодействующие ионы можно разделить на два различных, но связанных между собой класса. К первому классу относят большие симметричные ионы, заряд которых экранирован от воды и которые взаимодействуют между собой сильнее, чем с молекулами воды, как это обсуждалось в предыдущей главе. Ко второму классу относят ионы, в которых заряженная группа присоединена к гидрофобной, и взаимодействие последней с макромолекулой или другими ионами обеспечивает их связывание. К этому классу относят красители и ионные детергенты, которые связываются с гидрофобными участками белков и могут вызывать их денатурацию, солюбилизируя внутренние гидрофобные группы белковой глобулы. Связывание с белками в ряду замещенных анионов соответствующей структуры возрастает с увеличением размера заместителей и почти не зависит от индукционных эффектов [3]. Также часто обнаруживают, что заряженные молекулы красителей, которые могут участвовать в некотором типе гидрофобного взаимодействия, связываются стехиометрически с противоположно заряженными группами белков, хотя небольшие ионы в тех же условиях практически не взаимодействуют с такими группами. [c.304]

Другим примером связывания внешних поглощающих групп с биологической макромолекулой могут служить недавние исследования эффекта Коттона в полосе Соре гемоглобина и миоглобина [87, 88]. Эти два вещества являются комплексами белков с гемами, каждый из которых имеет характерную для порфиринов полосу поглощения около 410 ммк. В нативных молекулах в области этой полосы поглощения наблюдается типичный эффект Коттона (рис. 23), который исчезает при денатурации белка. Сходный эффект Коттона был обнаружен у комплексов гемина с синтетическим полипептидом, а именно с П0ЛИ-1--ЛИЗИН0М [89]. Этот эффект Коттона, так же как эффект Коттона у системы синтетический краситель — полипептид, зависит от конформации. [c.287]

Другой областью применения гель-хроматографии в биохимии является отделение белков от низкомолекулярных мешающих анализу примесей, например аминокислот, сахаров, стероидов или реагентов, используемых для химической модификации белка. Методом гель-хроматографии чаще всего удаляют реагенты, предназначенные для введения в белок радиоактивной и флуоресцентной меток. Гель-хроматография позволяет также быстрее и эффективнее, чем диализ, осуществить обессолива-ние или смену буфера, требуемые в определенных схемах фракционирования, а также удаление кофакторов и ингибиторов, используемых при изучении кинетики ферментативных реакций. Кроме того, с помощью этого метода можно изучать связывание белков с низкомолекулярными соединениями, например лекарственными веществами, ионами металлов и красителями [10]. Коэффициент распределения Ка некоего стандартного белка с из- [c.106]

Для понимания роли белка при связывании лиганда с бачками гема необходимо исследовать связывание лиганда с изолированным протогемом (т. е. без белка) в растворе. Атом железа в геме соединен четырьмя связями с атомами азота в порфири не и одной аксиальной связью с молекулой П О, вторая аксиальная связь остается свободной либо замыкается на молекулу СО, Альбердинг с сотр. 1361, используя для фотодиссоциации импульс лазера на красителе (кумарине) с длиной волны 540 нм и длительностью [c.107]

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров - один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образна Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает на окуляр свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции (рис. 4-6). Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспенифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой либо внутри фиксированной клетки (см. разд. 4.5.3). Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом (рис. 4-7). Применяя [c.177]