Галактозидаза фрагменты

Полученный синтетический ген был встроен вместе с фрагментом природной ДНК, содержащим промотор и проксимальную часть гена белка -галактозидазы кишечной палочки Е. сой, в плазмиду- [c.133]

Фракции плазминогена кролика Фрагменты р-галактозидазы [c.333]

ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЕТЕРОЛОГИЧНЫМ ФРАГМЕНТАМ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ -ГАЛАКТОЗИДАЗУ [c.138]

Регистрируя оптическую плотность белкового материала с помощью соединенного с колонкой высокочувствительного спектрофотометра, нанесите еще раз фракцию диализованных антител, полученных на стадии 4, на аффинную колонку с иммобилизованной -галактозидазой, уравновешенную PBS для удаления возможных примесей антител к -галактозидазе. Теперь фракция, сходящая с колонки, должна содержать только антитела к чужеродному фрагменту гибридного белка. [c.168]

Минимальный эффективный размер оператора, с которым может связаться молекула La -репрессора, составляет 17 пар оснований (выделены жирным шрифтом). В каждый данный момент времени с оператором связаны две субъединицы репрессора. Внутри последовательности в 17 пар оснований по крайней мере одно основание каждой пары принимает участие в узнавании и связывании репрессора. Связывание происходит в основном в большой бороздке ДНК без нарушения нормальной двухспиральной структуры области оператора. Участок молекулы репрессора, включающий первые 52 аминокислотных остатка, связывается с ДНК, не проявляя, судя по всему, специфичности к какой-то определенной последовательности. Другая область репрессора (остатки с 53 по 58) строго специфично связывается с 17-звенным фрагментом операторной области протяженностью 6—7 нм. Аминокислотные остатки в положении 74—75 особенно важны для связывания индуктора с молекулой репрессора. Операторный локус находится между промотором, к которому перед началом транскрипции присоединяется ДНК-зависимая РНК-полимераза, и началом гена Z— структурного гена 3-галактозидазы (рис. 41.3). Присоединившись к оператору, репрессор препятствует транскрипции операторного локуса и дистальных структурных генов Z, Y vi А. Таким образом, репрессор является негативным регулятором в его присутствии подавляется экспрессия Z, У и Л-генов. Обычно на клетку приходится 20—40 тетрамерных молекул репрессора и 1—2 операторных локуса. [c.113]

Р-Галактозидазы присутствуют в животных тканях в нескольких формах. И хондроитинсульфат, и кератансульфат содержат Р-галактозиды и поэтому служат субстратами для кислых галактозидаз. При недостаточности кислой Р-галактозидазы наряду с Ом -ганглиозидами накапливаются кератансульфат и фрагменты гликопротеинов (см. гл. 25). [c.316]

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадий литического цикла, поместить ген la Z Е. соН, кодирующий -галакгозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геном A MNPV, то в присутствии хромогенного субстрата -галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет. [c.144]

Имеются вполне определенные данные о том, что некоторые ферменты также являются гликопротеинами. К ним относится така-амилаза А, содержащая ксилозу и маннозу в соотношении I 8, из которой выделены протеолизом гликопептидные фрагменты Ч Рибонуклеаза В из панкреатического сока имеет углеводную компоненту, содержащую маннезу nN-аце-тилглюкозамин (3 1) - Аномально высокое есдержание углеводов обнаружено в Р-галактозидазе из слизистой оболочки желудка . Имеются, сведения о содержании углеводов и в других ферментах. [c.578]

Гибридный белок САТ-кальцитонин [20] (табл. 4.11) был сконструирован так, чтобы его можно было очистить субстрат-аффинной хроматографией. Когда обнаружилось, что гибридный белок находится в нерастворимом состоянии, стало очевидным, что этот подход неприемлем. Другие гибридные белки, приведенные в табл. 4.11, были также сконструированы с расчетом на очистку с помощью аффинной хроматографии. Для выделения составного белка -галактозидаза-Х использовали -aминoфeнил- -D-тиoгaлaктoзид (субстратный аналог -галактозидазы [27]) и белок А, специфически связывающийся с фрагментом F иммуноглобулина G [28]. Эти гибридные белки, синтезируемые в клетках Е. oli, растворимы метод их очистки описан в разд. 4.4. [c.113]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

В отличие от Agtll гибридные белки с -галактозидазой, кодируемые плазмидами pUR, обычно сохраняют ферментативную активность. Примерно 18 С-концевых аминокислотных остатков -галактозидазы, отсутствующие в гибридных белках, синтезируемых в gll, необходимы для проявления ее ферментативной активности. По нашим данным, гетерологичные фрагменты гибридных белков, включающих -галактозидазу, также более стабильны в клетках Е. соИ, когда соответствующие гены экспрессируются в pUR-векторах, а не в Agtll. Возможно, это свидетельствует о влиянии конформации -галактозидазы на конформацию гетерологичного белкового фрагмента в составе белкового гибрида. [c.140]

Рпс. 5,3. Два примера аномального поведения гибридных белков. Фрагмент кДНК Antennapedia был встроен в вектор Xgtll в двух разных рамках считывания. Самый большой по размеру из мажорных продуктов (дорожка 1) синтезируется при считывании с неправильной рамкой, но вследствие чрезвычайно высокого содержания G в ДНК и пролина в белке образующийся продукт обладает такой же подвижностью, как продукт, кодируемый правильной рамкой считывания черная стрелка, дорожка 1). Вторая рамка считывания (дорожка 2) правильная, и размер ее мажорного продукта (дорожка 2, черная стрелка) также соответствует заранее рассчитанному. Однако этот белок не является полноразмерным гибридным белком. Минорный продукт большего размера (дорожка 2, светлая стрелка) выявляется при окрашивании с использованием антител к -галактозидазе (данные не представлены) и антител к С-концевому участку белка (данные не приведены). Высокое содержание пролина в гибридном белке приводит к увеличению кажущейся молекулярной массы на 10—15 кДа. Этим объясняется ошибочный вывод о том, что обладающий низкой подвижностью продукт деградации является полноразмерным белком. [c.146]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Антитела выделяют, как описано в табл. 5.7. Поскольку фракция антител, специфичных к геторологичному фрагменту гибридного белка не связывается с колонкой, ее собирают без значительных потерь, промывая колонку PBS. Элюируемая фракция антител, специфичных к -галактозидазе, служит хорошим контролем в опытах, где используются антитела к гибридным белкам, и может применяться для приготовления аффинных колонок для выделения гибридных белков (см. ниже). [c.165]

Препарат антител, очищенных стандартным способом, как описано в этом разделе, не будет связываться с -галактозидазой или антигенами Е. oli, а будет взаимодействовать со всеми формами гибридного белка, содержащими антигенные детерминанты гетерологичного фрагмента (рис. 5.4, крайняя правая дорожка). [c.169]

Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

Разработанные методы получения иммуноферментных конъюгатов с р-галактозидазой, содержащей до 20 5Н-групп, основаны на том, что связывание через них антигенов не отражается на каталитических свойствах фермента. Восстановленный меркапто-этанолом 1дО или его РаЬ-фрагменты связываются с р-галакто-зидазой с помощью N—Ы -о-фенилендималеимида, специфически реагирующего с 5Н-группами белков. Выход конъюгата по ферменту достигает 50% при высоком сохранении компонентами специфических свойств. Сульфгидрильную группу можно ввести в мягких условиях в соединения, содержащие аминогруппы, поэтому данная методика может быть распространена на целый ряд антигенов. [c.110]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология