Кодоны клонирование

Необходимость в химическом синтезе нуклеотидной последовательности, кодирующей какой-то конкретный белок, может возникнуть тогда, когда клонирование соответствующего гена затруднено. При этом нуклеотидную последовательность гена находят из данных об аминокислотной последовательности белка. К химическому синтезу прибегают и тогда, когда кодоны, из которых состоит данный ген, плохо считываются организмом-хозяином, и уровень трансляции оказывается очень низким. В таком случае можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), при котором аминокислотная последовательность кодируемого белка остается прежней, а кодоны считываются хозяйским организмом более эффективно. [c.86]

Самое простое правило, которым следует руководствоваться при подготовке последовательностей для клонирования в ретровирусных векторах, — уменьшение их длины до того минимума, который только необходим для экспрессии белка. Это позволит избежать непредсказуемых трудностей сопряженных с экспрессией или лабильностью системы. В любом случае вставка должна быть достаточно мала, чтобы суммарный размер геномной РНК, предназначенной для упаковки, не превышал 10—И т. п. н. [14]. Идеальным можно считать фрагмент ДНК, включающий полную открытую рамку считывания с о - и З -фланкирующими последовательностями, которые были бы как можно более короткими. Особое внимание следует уделить элиминации последовательностей, влияющих на транскрипцию или процессинг РНК, — таких, как промоторы или сигналы полиаденилирования. Добавочные кодоны AUG выше предполагаемой точки начала трансляции также нежелательны, так [c.286]

Чтобы получить какой-то белковый продукт, необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции в нужном сайте необходим промотор, а для ее остановки - терминирующий кодон. Клонированный ген часто бывает лишен таких сигнальных последовательностей, и для его экспрессии в прокариотической клетке-хозяине нужно обеспечить и то, и другое. Кроме того, поскольку для решения большинства биотехнологических задач белок должен образовываться в больших количествах, необходимо использовать промотор, который позволял бы получить высокий уровень транскрипции (сильный промотор) и распознавался РНК-полимеразой хозяйской клетки. Постоянная транскрипция клонированного гена истощает энергетические ресурсы хозяйской клетки, поэтому нужно использовать промоторы, работу которых можно регулировать либо с помощью специфических низкомолекулярных соединений, либо изменением температуры. [c.130]

Вскоре была определена нуклеотидная последовательность вставки клона Hif-2h и на его основании аминокислотная последовательность, кодируемая внутри открытой рамки считывания. Эта последовательность содержала 189 аминокислот. К тому моменту стала известна первичная структура N-концевого участка одного из лейкоцитарных интерферонов человека, выявленная путем анализа высокоочищенного белка. Из сравнения аминокислотных последовательностей стало ясно, что первая аминокислота зрелого интерферона соответствует 24-му кодону клонированной последовательности, т. е. интерферон Hif-2h (названный интерфероном al) синтезируется в виде предшественника и при созревании и секреции из клеток отщепляет сигнальную последовательность длиной в 23 аминокислоты. Сам зрелый интерферон al содержит 166 аминокислотных остатков. Далее оказалось, что существует различие в пяти аминокислотных остатках из 20 между N-концевой последовательностью интерферона al и последовательностью лейкоцитарного интерферона, которую определили путем анализа из фракций высокоочищенного белка. Вскоре Вейсман с сотрудниками клонировали еще один ген лейкоцитарного интерферона (названный интерфероном о2, или оА) и определили его нуклеотидную последовательность. Соответствующая ей аминокислотная последовательность содержала 165 аминокислот и была сходна, но не идентична последовательности интерферона оА. Из этих результатов стало ясно, что имеется по крайней мере три разных лейкоцитарных а-интерферопа. [c.192]

Миллер, Лу и их сотрудники [145а, Ь] с успехом использовали супрессорные мутации и получили с их помощью около 300 мутантных типов Za -репрессорного белка Е. соИ. На первом этапе вводили атЬег-мутации приблизительно в 80 положений гена. Далее с целью клонирования мутантные гены переносили в эписомы (см. следующий раздел). Затем эти вирусоподобные эписомы использовали для заражения пяти штаммов бактерий, несущих супрессорные мутации, благодаря которым считывание кодона UAG (терминирующего) приводило к включению в белок различных аминокислот. Из этих инфицированных бактерий выделяли большие количества мутантных форм 1ас-репрессора. Оказалось, что многие мутации, локализованные вблизи от N-конца, влияют на связывание репрессора с ДНК, тогда как мутации, локализованные в центральной части, влияют на связывание с индуктором. [c.256]

Клонируемый ген встраивают в N ol-, Pst -или // иёШ-сайт, расположенный между сайтом связывания рибосомы и сайтами терминации транскрипции. Если его рамка считывания не попадает в ногу с кодоном AUG, то необходимо произвести минимальную коррекцию. В этом случае после индукции и транскрипции происходит достаточно эффективная трансляция клонированного гена. Однако следует иметь в виду, что поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевой участок белка-мищени, у разных клонированных генов неодинакова, нельзя создать универсальный вектор, исключающий одноцепочечное спаривание мРНК при любых обстоятельствах. Поэтому ни одна из областей инициации трансляции, как бы она ни была оптимизирована, не может га- [c.121]

Эффективной трансляции может препятствовать и несовместимость клеток, обусловленная тем, что в клонируемом гене имеются кодоны, редко встречающиеся в геноме организма-хозяина. В таких случаях в хозяйской клетке может не доставать транспортных РНК (тРНК), узнающих редко используемые кодоны, что снижает выход продукта клонированного гена. Как рещить эту проблему - не совсем понятно. Если продукт клонированного гена очень ценен, можно попытаться химически синтезировать такой вариант клонируемого гена, который состоит из кодонов, обычно используемых хозяйским организмом (оптимизация кодонов). [c.121]

Методы клонирования и секвенирования ДНК позволили провести тщательный сравнительный анализ генетической организации митохондриальных геномов у целого ряда организмов, от грибов до человека. Определение полной нуклеотидной последовательности человеческой митохондриальной ДНК, содержащей 16 569 нуклеотидных пар, было завершено в 1981 г. Известны также частичные последовательности митохондриальных геномов быка, дрожжей и Neurospora. Полученные результаты свидетельствуют о том, что митохондриальные геномы высших и низших эукариот, кодирующие примерно один и тот же набор функций, в то же время характеризуются различиями в смысловом значении некоторых кодонов, в правилах антикодон-кодонового узнавания и существенными различиями в общей структурной организации. Можно полагать, что существенным фактором эволюции митохондриальных геномов была селекция на максимальную структурную компактность при максимальной информационной нагруженности (см. Дополнение 12.1). Это, вероятно, достигалось за счет таких изменений генетического кода, которые позволили сократить необходимый для считывания набор тРНК. При этом митохондрии млекопитающих, характеризующиеся наиболее компактной организацией генома, подверглись соответ- [c.95]

Векторы, обеспечивающие синтез белка, кодируемого клонированным геном, называют экспрессирующими. Такие векторы широко используют для выявления специфических кДНК молекул в кДНК-библиотеке, а также для наработки генно-инженерных белков. Специально сконструированные экспрессирующие векторы имеют, как правило, сильный индуцибельный промотор, кодоны инициа- [c.42]

М. Krystal и соавт. [39] секвенировали клонированные кДНК-копии гена НА B/Lee/40. Полная последовательность НА была получена при помощи двух клонов, один из которых простирался от синтетического олигонуклеотида, использованного в качестве праймера при синтезе кДНК, до 1336 основных пар. Второй клон начинался с нуклеотида 483 и простирался до 5 -конца вирионной РНК, что облегчило определение полной последовательпости. Общая длина составляет 1882 нуклеотида. Первый АУГ начинается в нуклеотиде 34, и в случае трансляции последовательности с этого инициирующего кодона предсказан белок из 584 аминокислот. N-терминальная последовательность начинается аминокислотой 16 [102]. Последовательность с 3-й по 15-ю аминокислоту неполярна и предположительно является сигнальным пептидом, как и у вирусов гриппа А [1, 22]. [c.276]

Для максимизации экспрессии существенным является соблюдение оптимального расстояния межд> SD-сайтом и инициирующим кодоном. Показано, что расстояние в 9 п. о. оптимально при экспресии лейкоцитарного оА (о2) и фибробластного интерферонов. Выход резко меняется при изменении расстояния. Так, для -интерферона выход составляет (%) 0.4 при расстоянии 2 п. о., 50 при 8, 1.6 при 15 п. о. (оптимум 100% — 9 п. о.). Вероятно, эти различия связаны с образованием вторичной структуры РНК ( шпильки ) и, следовательно, зависят от последовательностей клонированного гена, окружения SD-сайта и состава кодонов между SD и ATG. Таким образом, структура сайта связывания с рибосомами должна оптимизироваться для каждого нового гена индивидуально. В целом вариации структуры сайта связывания с рибосомами могут дать изменение экспрессии приблизительно в 10 раз. [c.195]

При реализации такого подхода из гена, клонированного в составе векторной плазмиды, по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который требуется внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонук-леотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на некоторых этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно определять функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами. [c.323]

Плазмидные векторы. Как уже отмечалось, для клонирования и экспрессии генов в клетках Е. oli обычно применяют различные модификации вектора pBR322, содержащие промоторы фага Л, лактозного и триптофанового оперона и их операторные участки. Благодаря последним экспрессию клонируемых генов можно регулировать, если плазмидная или бактериальная ДНК несет гены соответствующих репрессоров. Из многих вышеперечисленных факторов, влияющих на экспрессию генов, решающими являются сила промотора и структура сайта связывания рибосом (RBS-сайта). Напомним, что этот сайт включает в себя начальные кодоны гена, поэтому нет простых путей, обеспечивающих эффективную экспрессию чужеродных генов в бактериях. Такой экспрессии добиваются двумя принципиально различными подходами (схемами) — путем [c.329]

Рис. 10.7. ei. a клонирования к эксп е-сии в клетках Е соИ xMNir4e KH синтезированн з1х -л В-цепей инс>лина с последующим созданием активного гормона, л — промотор > — инициирующий ко- i. i — терминирующий кодон [c.341]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология