Гибридизация нуклеиновых кислот в растворе

Так как при денатурации нуклеиновых кислот их первичная структура сохраняется, то данный процесс может иметь обратимый характер. На способности нуклеиновых кислот восстанавливать свою нативную конформацию после денатурации (ренативация) основан чрезвычайно важный метод определения степени гомологичности, или родственности, нуклеиновых кислот. Этот метод называют молекулярной гибридизацией. Сущность этого метода (рис. 8.15) сводится к следующему сначала смешиваются растворы ДНК, вьщеленных из организмов разного вида (например, лягушки и кролика) затем эти растворы нагревают (для денатурации ДНК), а потом охлаждают. При этом возникают двухспиральные структуры разного состава наряду с двухспиральными молекулами, идентичными исходным ДНК, могут образовываться гибридные ДНК, содер- [c.283]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

В общих чертах метод гибридизации заключается в совместной инкубации двух одноцепочечных препаратов нуклеиновых кислот и последующем измерении количества образованных дуплексов. Существуют два основных способа проведения этой реакции гибридизация в растворе и гибридизация на фильтре. [c.36]

ГИБРИДИЗАЦИЯ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ. Реакция между комплементарными цепями нуклеиновой кислоты, происходящая в растворе, [c.520]

Общеизвестно, что нуклеотидный состав фрагментов ДНК влияет на температуру их плавления. Оптимальные условия для отжига и отмывки нуклеиновых кислот в реакциях гибридизации подбирают исходя из их нуклеотидного состава. В гораздо меньшей степени учитывается вклад стэкинг-взаимодействий в термодинамическую стабильность двойной спирали. А между тем энергия таких взаимодействий между соседними нуклеотидами одной цепи ДНК, удерживающих ее в скрученном состоянии в физиологических растворах, больше энергии водородных связей комплементарного спаривания [29]. Порядок чередования оснований определяет степень стэкинга и, следовательно, влияет на термостабильность фрагмента ДНК. Даже единичная нуклеотидная замена может так сильно сказаться на стэкинг-взаимодей-ствии, что Гт изменится более чем на 1 °С. Поскольку процесс плавления домена практически полностью определяется кооперативными взаимодействиями, любая единичная нуклеотидная замена в любой его точке будет менять температуру плавления. [c.129]

Скорость формирования двойной спирали лимитируется вероятностью столкновения двух комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот, что в свою очередь определяется их концентрацией в растворе. Скорость гибридизации может быть использована для определения концентрации любых последовательностей РШС или ДНК в смеси, содержащей и другие последовательности нуклеиновых кислот. Для этого теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДШС, комплементарный к той последовательности, которую нужно обнаружить. Этот фрагмент ДНК можно получить клонированием, а если последовательность короткая, ее можно синтезировать химическими методами. В любом случае фрагмент ДНК интенсивно метят Р (см. рис. 4-65) с тем, чтобы можно было следить за включением этой молекулы в состав дуплексов в процессе реакции гибридизации. Одноцепочечная молекула ДНК, используемая здесь в качестве индикатора, называется ДНК-зонд она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. [c.238]

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любьсс последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч- [c.110]

С практической точки зрения важна реакция иодирования нуклеиновых кислот в водных растворах. При действии 1 или 1 -ионов в присутствии треххлористого таллия СТ1С1 ) на одиоцепочечные ДНК преимущественно иодируется цитозин, образуя 5-иодопроиз-водные. При реакции с РНК наряду с 5-иодцитозином образуется 5 иодо-6-гидрокси-5,6-дигидроурацил. При использовании радиоактивного 4 удается получить меченые полинуклеотиды с высокой удельной активностью, которые применяются в опытах по гибридизации. [c.387]

В рекомбинационной ДНК-технологии фрагменты нуклеиновых кислот, вырабатываемых при обработке двухнитевой ДНК ограниченными эндонуклеазами, выделяются электрофоретически на агаровых или полиакриламидных гелях. Окрашиванием этидиумбромидом добиваются того, что выделенные ленты становятся видимыми. Затем ДнК денатурируется обработкой щелочью и помещается в буферный раствор. Ленты ДНК переносят на нитратцеллюлозные мембраны тампоном по методике, называемой Сазенов-ским переносом [16]. После окончания переноса и термофиксации нуклеиновых кислот процедура гибридизации выполняется, как описано выше. [c.88]

Денатурация и ренативация ДНК. Гибридизация ДНК — ДНК и ДНК — РНК. Двухцепочечные структуры ДНК при нагревании, экстремальных значениях pH, обработке мочевиной могут переходить в форму неупорядоченных клубков — денатурироваться. Молекулы нуклеиновых кислот максимально поглощают ультрафиолет при 260 нм за счет поглощения азотистых оснований. Раствор нативной ДНК имеет при 260 нм оптическую плотность на 40% ниже оптической плотности смеси нуклеотидов —. гиперхромный эффект. Поэтому о денатурации ДНК судят по увеличению Е250- При нагревании поглощение при 260 нм возрастает в узком диапазоне температур (точка плавления 80—85 °С). Денатурация обратима, если остались спирализованные участки ДНК. Восстановление структуры ДНК после удаления денатурирующего фактора (за счет комплементарного спаривания оснований нуклеотидов) называется ренативацией ДНК. На явлении денатурации ренативации основан метод гибридизации. [c.295]

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересующий нас ген это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибридизировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК. [c.282]

Для определения концентрации ДНК в растворе широко используются 3 метода. Наиболее простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Однако, если содержание сумарной фракции ДНК невелико, концентрацию ее можно определить по интенсивности флуоресценции ее комплексов с бромистым этидием или бисбензимидом (Н33258), либо методом гибридизации со специфичным олигонуклеотидом. В таблице 6 представлены данные по чувствительности и специфичности спектрофотометрического и флуориметрическо-го методов анализа нуклеиновых кислот. [c.178]

Для гибридизации ДНК/ДНК, когда как связанная, так и гибридизированная нуклеиновые кислоты является одноните-выми ДНК, необходимо предварительно обработать мембрану, чтобы блокировать центры неспецифического связывания ДНК на нитроцеллюлозе. С этой целью Денхардт [61] успешно использовал 0,02 %-ные растворы фикола, поливинилпирролидона и бычьего сывороточного альбумина. [c.320]

Если раствор ДНК, денатурированной нагреванием, охлаждать, то вновь возникают слабые связи, и при определенных условиях могут получиться двуспиральные структуры, идентичные структурам исходного (до денатурации) препарата т. е. произойдет ренативация (отжиг ДНК). На явлениях денатурации и ренативации основс1н метод молекулярной гибридизации, который применяют для изучения строения нуклеиновых кислот, а также для их фракционирования. [c.112]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология