Гликопротеины, мечение

Рис. 5.4 иллюстрирует результаты разделения меченных [ S]-метионином белков РСВ в пластине 10%-ного полиакриламидного геля. Вирусные гликопротеины можно пометить аналогичным методом, используя в качестве метки 50 мкКи/мл [1- Н]-глюкозамина или [ Н]-маннозы. [c.142]

БОЕ/кл. Через определенные промежутки времени после заражения проводят импульсное мечение. Для этого культуральную среду в чашках заменяют на 1 мл PBS, содержащего 30 мкКи [ S]-метионина и 25 мкКи [ S]-цистеина (или 100 мкКи [ Н]-маннозы для введения метки в гликопротеины), и инкубируют чашки при 31 °С 1 ч. [c.144]

Эти значения устойчивости чистых сахаров в горячих минеральных кислотах могут дать лишь весьма приближенное представление об их устойчивости в процессе гидролиза гликопротеинов, что объясняется несколькими причинами. Во-первых, происходит катализируемая кислотами реакция между свободными сахарами и такими аминокислотами, как триптофан, цистин, цистеин и метионин, ведущая к предпочтительному расщеплению этих аминокислот [8, 9] (см. также гл. 5). Однако имеется мало сведений о расщеплении в горячем кислом растворе сахаров в присутствии этих аминокислот известно, что цистеин повышает скорость деструкции маннозы [7, 10]. Некоторые поправки на исчезновение сахара можно ввести с помощью модельных экспериментов, в которых измеряют деструкцию, нагревая смеси, содержащие исследуемый сахар и аминокислоты, аналогичные тем, которые присутствуют в гидролизате изучаемого гликонротеина. Другим приемом является прибавление изотопно меченного сахара к гликопротеину перед гидролизом, выделение сахара или его производного и вычисление количества, присутствовавшего в гликопротеине, из данных изотопного разбавления [7]. Во-вторых, восстанавливающая группа моносахарида в условиях кислотного катализа может реагировать с первичной или даже со вторичными гидроксильными группами другой молекулы сахара, давая ди- или олигосахариды эта реакция называется кислотной реверсией [И, 12]. Такого рода бимолекулярные побочные реакции можно в значительной степени устранить, проводя гидролиз при низкой концентрации вещества. Однако таким способом нельзя избежать другого возмоншого источника ошибок. Сахар может предпочтительно освобождаться в виде переходного оксониевого или карбониевого иона, который, вероятно, будет легко взаимодействовать с реак- [c.196]

Эту же технику использовали для изучения мембранных белков, не содержащих хромофоров. Вначале к таким белкам присоединяли флуоресцентные лиганды. Обычно для этой цели брали флуоресцентно меченные моновалентные антитела (т. е. фрагменты антител с одним участком связывания антигена и. следовательно, неспособных к сшиванию соседних молекул). Затем эти привязанные лиганды обесцвечивали лазерным лучом, после чего измеряли время, необходимое для того, чтобы мембранные белки, несущие необесцвеченные антитела, переместились путем диффузии в обесцвеченную область (рис. 6-35). Измеренные таким образом скорости диффузии различных гликопротеинов плазматической мембраны обычно оказывались по крайней мере в 5-50 раз меньше, чем у молекул родопсина. Относительно низкие скорости диффузии не являются свойством, внутренне присущим иидивидуаль- [c.374]

Рис. 4.13. Внутриклеточный транспорт меченых компонентов, по данным радиоавтографии. А. Перенос Н-пролина в зрительную кору обезьяны. Инъекция произведена в один глаз Н-пролин включился в белок ганлиозных клеток сетчатки, перешел в их окончания в латеральном коленчатом теле и затем в те его клетки, которые проецируются на кору. Прерывистые полосы— колонки глазодоминантности (см. гл. 17). (Wield et al., 1974) Б. Транспорт Н-фукозы в дендриты мотонейрона после внутриклеточного введения тело клетки, где сахар включается в гликопротеин (foeuzberg et al., 1975).

Мутантные клетки заражали вирусом везикулярного стоматита, после чего эти клетки начинали производить вирусный гликопротеин. В мутантные и нормальные клетки вводили предшественник Gl NA , меченый тритием, и затем клетки сливали. Вирусный гликопротеин находился только в цистернах аппарата Гольджи клеток мутантного типа, но только в цистернах клеток нормального типа к этому гликопротеину могла быть присоединена галактоза. Таким образом, если бы гликопротеин, к которому в средних цистернах присоединился меченый остаток Gl NA , не покидал бы цистерн мутантных клеток, он был бы лишен остатка галактозы. После слияния клетки инкубировались в течение определенного промежутка времени, необходимого для передвижения гликопротеинов по цистернам аппарата Гольджи, а затем разрушались. На колонках с антителами к вирусному гликопротеину выделялся этот белок, а потом с помощью лектина-рицииа осаждался гликопротеин, содержащий галактозу. Оказалось, что 50% вирусного гликопротеина содержат галактозу. Авторы считают, что этот факт можно объяснить только тем, что из срединных цистерн мутантных клеток меченый гликопротеин с равной веро- [c.183]

Последующие процедуры лучше всего проводить в холодной комнате. Нерастворимый материал осаждают с помощью настольной центрифуги. Раствор вносят в колонку с L H-сефаро-зой. Скорость потока должна составлять 0,5 мл/мин. После нанесения образца колонку промывают десятикратным объемом (примерно 50 мл) L H-буфера. Если в пробе присутствуют белки, меченные то элюцию материала с колонки можно контролировать на сцинтилляционном счетчике. После промывания колонки с нее снимают адсорбированные гликопротеины с помощью 2%-ного а-метилманнозида и фракции с максимальной активностью объединяют. Полученный материал диализуют 3 ч против буфера для реассоциации (состав буфера см. в разд П1, Г). [c.152]

Гранулярный эндоплазматический ретикулум гиперплазиру-ется В меньшей степени и представлен чаще узкими, реже расширяющимися в виде цистерн канальцами, которые часто расположены рядами вдоль длинной оси клетки. Кроме рибосом, фиксированных в виде цепочек или розеток на мембранах ГЭР, много свободных рибосом и полисом. Так как по данным световой и электроиной (рутениевый красный) гистохимии в этот период на наружных оболочках клеток и в межклеточной среде присутствует большое количество ГАГ и лишь отдельные кол-лагеновые фибриллы (см. раздел 2.2.4), то можно заключить, что описанная ультраструктура характерна в основном для синтеза и секреции ГАГ. Действительно, электронная гистохимия и авторадиография с мечеными предшественниками ГАГ (см. раздел 2.1.1) свидетельствует о синтезе последних в пластинчатом комплексе. Юные фибробласты продуцируют также структурные гликопротеины, о чем свидетельствует появление в их непосредственном окружении микрофибрилл. [c.19]

Более изящное использование щелочной фосфатазы как метки продемонстрировано Дойлом и др. [3, 4]. В качестве модельного антигена авторы использовали оросому-коид из сыворотки крови человека, представляющий собой небольшой гликопротеин (молекулярный вес 41 ООО), который имеет отношение к различным злокачественным образованиям [4] и, по-видимому, связан с карциноэмбриональным антигеном. В этот белок вводили метку щелочной фосфатазы. В системе проходила конкурентная реакция между антителом к белку оросомукоида, иммобилизованным на поверхности кюветы, и белком, меченным ферментом. Через соответствующий промежуток времени кювету промывали и добавляли раствор субстрата-фенилфосфата, который под действием [c.59]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология