Маркеры для седиментации

Молекулярный вес продуктов диссоциации определяют как химическими (ср. разд. 10.2.3 и 10.2.4), так и физическими методами. Для установления молекулярного веса обычно используют методы ультрацентрифугирования (седиментация, диффузия, седиментационное равновесие [104, 105, ПО—115]), измерения светорассеяния [116—118] и осмотического давления [136. Характеристическая вязкость полимерных цепей в конформации статистического клубка связана простым соотношением с молекулярным весом. Следовательно, он может быть найден по измерению вязкости [137] (ср. разд. 10.2.7.5). Плотности и вязкости различных водных растворов представлены в табл. 2. Размер полипептидных цепей при денатурации можно оценить пО полипептидам-маркерам с известными молекулярными весами при электрофорезе в полиакриламидном геле (ср. разд. 10.2.7.4) и гель-фильтрации (ср. разд. 10.2.7.5). [c.414]

ПО возможности одинаковым. Последняя предосторожность позволяет избежать искажения коэффициента седиментации из-за увеличения плотности раствора сахарозы. Достаточные для обнаружения зон количества исследуемого вируса и маркеров центрифугируют в параллельных градиентах. Коэффициент седиментации исследуемого вируса можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им в градиенте, с расстоянием, пройденным маркерами. В этом случае зоны локализуют визуально, освещая пробирки сверху и измеряя расстояние от мениска (однако данный способ не отличается большой точностью). Можно также пропустить градиент через проточную [c.25]

Это соотношение подсказывает простой способ определения константы седиментации исследуемых молекул путем сопоставления их с маркером — веществом такой же природы (белок, ДНК или РНК), но с известным значением Sjo.w. Оба эти вещества надо, предварительно смешав, разделить зонально-скоростным центрифугированием в изокинетическом градиенте плотности, а затем по соотношению расстояний, пройденных их зонами от мениска, рассчитать искомую величину S2o,w = S2o, m(///m). Буквой м обозначен маркерный препарат. Для цилиндрической части пробирки отношение расстояний от мениска можно заменить отношением соответствующих им объемов. Опорожнять пробирку в этом случае удобнее, начиная с мениска (см. ниже). Объемы нередко заменяют числом капель. При этом следует проявлять осторожность, так как объем падающей в коллектор капли зависит от поверхностного натяжения и плотности жидкости, а они неодинаковы на разных участках градиента плотности. [c.205]

Еще лучше использовать два маркера, один из которых оседает быстрее, а другой — медленнее, чем интересующая исследователя зона. Константу седиментации для этой зоны можно рассчитывать по известным константам седиментации маркеров и относительному расположению пика зоны препарата между пиками маркеров путем линейной интерполяции. [c.206]

В качестве маркеров для РНК удобно использовать рибосом-ные РНК с константами седиментации 16S и 23S (бактериальные), 5S, 18S и 28S (из рибосом животных), а также транспортные РНК (s2o,w=4S). Маркерами для ДНК часто служат двунитевые фаговые ДНК определенной структуры. Ниже приведены характеристики некоторых из них [c.206]

Следует указать, что количественная характеристика внутриклеточных органелл зачастую затруднена. Это обусловлено тем, что изопикнические точки различных органелл могут перекрываться, и фракционирование при одной и той же скорости седиментации приводит к оседанию фрагментов нескольких органелл. Трудности идентификации могут быть также связаны с тем, что различные ткани имеют разные маркеры для одних и тех же органелл. Например, маркерные ферменты одного типа мембран могут проявлять активность и в других типах мембран, например, 5 -нуклео-тидазой в основном обогащены плазматические мембраны, однако эта активность присутствует также в аппарате Гольджи и эндоплазматической сети. [c.236]

При определении 5 с помощью зонального центрифугирования часто используют стандартные образцы (маркеры), значения з которых предварительно были определены методом аналитического ультрацентрифугирования. Однако даже в том случае, когда концентрация достаточно низка, чтобы можно было не принимать во внимание концентрационную зависимость седиментации (которая может достигать большой степени, если материал недостаточно чист), определение с помощью зонального центрифугирования имеет подводные камни, которые не встречаются в аналитическом ультрацентрифугировании. Это можно объяснить тремя основными причинами. Во-первых, плотность и вязкость раствора увеличивается вдоль пробирки, поэтому суммарная сила, действующая на молекулу, здесь уже не является простой функцией расстояния. Во-вторых, стенки препаративных пробирок параллельны, поэтому они не совпадают с направлением седиментации, в результате чего происходит седиментация по стенкам с накоплением вещества. Это накопление приводит к локальным инверсиям плотности, вызывая некоторую конвекцию. В-третьих, значение 8 рассчитывается только по двум точкам, положению при времени, равном нулю, и после остановки центрифуги, так что истинная скорость движения остается неизвестной. Первая причина может быть рассмотрена очень сложным теоретическим путем, вторая теоретически описана, однако влияние ее на 5 до конца не установлено. Для избежания трудностей, связанных с первой причиной, обычно применяют изокинетические градиенты, т. е. концентрацию и плотность градиента подбирают таким образом, чтобы молекулы двигались с постоянной скоро- [c.311]

Если указанные условия не соблюдаются, то для определения значения 5 можно воспользоваться косвенными методами. Мартин и Эймес [16] использовали в качестве маркеров ферменты с известными коэффициентами седиментации, Стэнворс с сотр. [17] — белки, меченные красителем, а Черлвуд [18] — белки, меченные радиоактивным изотопом. Если присутствие такого маркера мешает движению исследуемого компонента, его седиментацию можно наблюдать в отдельной контрольной пробирке. [c.69]

Фиг. 177. График седиментации в градиенте плотности s l частиц инфекционного фага Р1 (светлые кружки) и фага Р1, трансдуцирующего маркер Leu+ (темные кружки), присутствующих в фаголизатах донорных клеток Е. соИ Leu+Thy, выращенных в пр и -сутствии бромурацила (БУ) или тимина (Т) в трех разных вариантах.

TOB контролируют на каждом этапе выделения и разделения мембран в исходном гомогенате и в каждой фракции с целью определения стадии осаждения и выхода исследуемых мембранных структур, а также потерь мембранных фракций. Гомогенность выделенного препарата мембран анализируют на основании увеличения активности маркерного фермента (-ов) в нем по сравнению с исходным гомогенатом клеток. Часто используют не один, а два-три мембранных маркера. Однако необходимо помнить, что и мембраны одного типа способны проявлять гетерогенность, связанную с асимметрией белкового, липидного и углеводного состава мембран, в результате чего фермент может находиться в латентной форме из-за нарушения ориентации мембраны и недоступности активного центра для субстрата, например, в обращенных мембранных везикулах. Наиболее легко из внзпрри-клеточных органелл идентифицируют митохондрии и ядра, затем — лизосомы и пероксисомы, наиболее трудно — плазматические мембраны и мембраны эндоплазматической сети. Сложность разделения последних обусловлена близостью величин диапазона плотностей этих структур, поэтому разделение по скорости седиментации осуществляется в том случае, если плазматические мембраны представлены крупными фрагментами. [c.223]

Равновесная седиментация по-настоящему эффективна толь- ко в тех случаях, когда антигенные частицы настолько велики, что оседают при низких и средних скоростях центрифугирования. Поэтому она лучше всего подходит для иммунологического исследования клеточной поверхности, например для изучения антителоподобных распознающих структур, антигенных маркеров, рецепторов для лектинов и т. п. Сама методика проста и экономна в отношении реагентов и при ускорениях порядка 10 000g или ниже не требует никакого специального оборудования. [c.44]

Пример 6. Очистка поли(А)-РНК [Mansson et al., 1979]. Предполагаемая константа седиментации для поли(А)-РНК — около 10S. В качестве маркера для уточнения этой величины выбрали рибосомальную 18S РНК. В первом варианте авторы использовали градиент 5—20% сахарозы и 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,6) с 5 мМ ЭДТА и 1% ДДС-Na (последнее — во избежание агрегации), ротор SW41Ti, ускорение 176 000 g, продолжи- [c.235]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология