Ультрацентрифугирование аналитическое

К аналитическим методам фракционирования относятся ультрацентрифугирование, турбидиметрическое титрование, гель-про никающая хроматография и др. Количественную картину распределения дает метод ультрацентрифугирования, однако он относительно сложен и требует дорогостоящего оборудования. Турбидиметрическое титрование — простой и быстрый метод, но он дает лишь качественную картину ММР. [c.95]

АНАЛИТИЧЕСКОЕ УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ РАСТВОРОВ ПОЛИМЕРОВ [c.13]

Различают аналитические и препаративные ультрацентрифуги. Аналитические ультрацентрифуги имеют оптическую систему, которая позволяет регистрировать на фотопленках результаты ультрацентрифугирования. В аналитических ультрацентрифугах производится также определение констант седиментации частиц, что позволяет затем рассчитывать их молекулярные веса. [c.125]

В период между 1925 — 1930 гг. Сведберг с помощью ультрацентрифугирования произвел определение молекулярных масс различных белков. Одновременно применение других аналитических методов, как, например, электрофореза и различных видов хроматографии, привело к развитию аналитической белковой химии. В 1951 — 1956 гг. Сенгер [20, 21] установил аминокислотную последовательность инсулина. Использованные при этом методы легли в основу систематического определения первичной структуры многих белков. Созданный Эдманом в 1966 г. секвенатор и применение масс-спектрометрии в сочетании с ЭВМ как средством регистрации, обработки и оценки масс-спектрометрических данных привели к тому, что к настоящему времени опубликовано более 15 ООО работ, посвященных определению аминокислотных последовательностей, и установлены первичные структуры более чем для 1000 белков. [c.343]

Среди аналитических методов фракционирования, с помощью которых можно было бы значительно ускорить процесс определения ММР, наибольшее распространение получили методы турбидиметрического титрования и транспортные методы [16], к которым относятся ультрацентрифугирование, диффузия, электрофорез и хроматография. Общее во всех этих методах - направленное движение макромолекул относительно гомогенной или гетерогенной окружающей среды под действием внешней силы гравитационного или электрического поля, осмотического давления, межфазного распределения. [c.334]

Современные методы установления строения полисахаридов применимы лишь к индивидуальным веществам. Работа с неочищенными полисахаридными препаратами может привести к выводам о строении, весьма далеким от истины. В то же время не существует вполне строгих критериев индивидуальности выделенного полисахарида, так же как нет употребительных для всех случаев методов контроля за процессом выделения. Полисахарид обычно считается индивидуальным, если не менее двух разных способов очистки не изменяют его мономерный состав и физико-химические свойства (например, удельное вращение, молекулярный вес), а общепринятые аналитические методы не выявляют наличия примесей (гомогенность по данным хроматографии, электрофореза, ультрацентрифугирования). [c.488]

Индивидуальность полученных препаратов гликопротеинов контролируется чаще всего аналитическим ультрацентрифугированием (см., например, ), электрофорезом с подвижной границей или на носителях, хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Как и в случае полисахаридов, критерием однородности выделенного гликопротеина может служить неизменность его мономерного состава (моносахаридов и аминокислот) и физико-химических свойств при применении нескольких способов очистки. Для определения нативности выделенных веществ особое значение имеет контроль их биологической активности, в первую очередь иммунологических свойств. [c.567]

Одна из сложностей работы с полисахаридами заключается в том, что не существует строгих критериев их гомогенности. Считается, что полисахарид индивидуален, если аналитические методы (хроматография, электрофорез, ультрацентрифугирование) не обнаруживают примесей, а различные способы очистки не меняют мономерный состав полисахарида и его физико-химические свойства. [c.467]

В этой ситуации книга Т. Боуэна заслуживает большого внимания. В ней в довольно сжатой форме описаны принципы основных методов аналитического и препаративного ультрацентрифугирования и показаны возможности их применения для изучения белков, [c.5]

Эти методы содержат чувствительные аналитические определения числа конечных групп в данном количестве полимера с использованием осмотического давления, ультрацентрифугирования или рассеянного света. [c.232]

Ультрацентрифугирование полимеров иногда применяют и в аналитических целях. В частности, таким путем можно получить сведения [c.45]

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

Различия в высшей структуре нуклеиновых кислот легко обнаруживаются по гиперхромному эффекту после тепловой или химической денатурации или после химического или ферментативного гидролиза. Важную информацию можно также получить при помощи других аналитических методов о гетерогенности по мол. массам, химическом составе и размерах молекул — методами ультрацентрифугирования [19, 35], о соответствии (комплементарности) первичной последовательности в двух полинуклеотидах— методами гибридизации [36, 37], о размерах и [c.68]

Фиг. 5. Разделение компонентов рибосомной РНК гороха путем аналитического ультрацентрифугирования с использованием оптики, предназначенной для работы в ультрафиолетовой области [3].

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

В течение многих лет предпринимались попытки создания аналитических методов фракционирования, с помощью которых можно было бы значительно ускорить процесс определения МВР. В настоящее время получили развитие методы турбидиметрического титрования, ультрацентрифугирования и гель-хроматографии. Общая черта этих методов — относительная быстрота определепия МВР и сложность аппаратуры. [c.339]

Сведения, касающиеся физических свойств рибосом высших растений, получены главным образом в результате работы с проростками гороха [1,34, 36, 37], хотя, как свидетельствуют данные электронной микроскопии и аналитического ультрацентрифугирования, рибосомы других видов растений, по-видимому, чрезвычайно сходны с рибосомами гороха [20, 45]. Рибосомы гороха на электронных микрофотографиях имеют вид сплющенных сфероидов диаметром около 250 А и высотой около 160 А (напыленные препараты). Коэффициент седиментации рибосом гороха составляет около 80S, а их молекулярный вес — около 4,1 -10 . Физические свойства рибосом гороха приведены ниже [c.22]

Фракционирование по молекулярным весам может быть как аналитическим, так и препаративным. Цель аналитического фракционирования заключается в нахождении молекулярновесового распределения исследуемого образца. Полученную кривую распределения можно далее сопоставить с другими характеристиками образца, например с методом синтеза или способом деструкции этого полимера, с физическими и механическими свойствами его. Выделение и характеристика каждой отдельной фракции, что является самой длительной и трудоемкой частью эксперимента, проводится только для того, чтобы построить кривую раснределения. С целью упрощения аналитического фракционирования широко применяются методы турбидиметрического титрования, ультрацентрифугирования и фильтрования через гель. Такие методы можно применять для получения кривых распределения по молекулярным весам, не выделяя каждую фракцию. Подробно указанные методы рассматриваются в других главах. Современный уровень знаний, однако, не позволяет применять большинство подобных методов без калибровки по аналитическому фракционированию с выделением каждой фракции и определением хотя бы молекулярного веса их. [c.61]

Заключительная оценка полноты очистки и гомогенности белка требует сочетания ряда применяемых методов. Для предварительного вывода о гомогенности необходимы прежде всего данные о невозможности дальнейшего фракционирования препарата всеми применимыми в данном случае методами. Разумеется, имеются в виду не все возможные приемы, а наиболее эффективные варианты основных методов фракционирования— ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, молекулярной фильтрации и др., причем не в препаративных, а в аналитических модификациях. При этом приходится считаться с опасностью того, что выявление, новых фракций может быть обусловлено частичной денатурацией белка при некоторых из этих процедур. С другой стороны, невозможность дальнейшего фракционирования может быть обусловлена недостаточным совершенством использованных разновидностей методов разделения. Нередко оказывалось, что применение более совершенных методов позволяло фракционировать белки, считавшиеся ранее гомогенными. [c.35]

Другой тип седиментационного эксперимента — это зонное ультрацентрифугирование или неравновесное ультрацентрифугирование в градиенте плотности, предложенное для аналитических целей Виноградом с сотр. [45]. Тонкий слой раствора полимера во время разгона ротора наслаивается на более плотный растворитель необходимый для этого вкладыш седиментационной ячейки описан в работе [46], а вопросы седиментации и диффузии макромолекул в зоне рассмотрены, например, в [47]. [c.22]

Очень компактное и вместе с тем полное руководство по применению ультрацентрифугирования в современных биологических исследованиях. После краткого исторического обзора и описания наиболее распространенных ультрацентрифуг автор последовательно рассматривает принципы и возможности оптических систем, используемых в аналитических центрифугах, способы измерения коэффициентов седиментации и диффузии, важнейшие методы определения молекулярной массы, основы количественного анализа смесей, а также методы препаративного ультрацентрифугирования. [c.4]

Вот уже на протяжении почти полувека ультрацентрифуга широко используется при изучении полимеров. С течением времени ее значение непрерывно возрастает. Биологи широко используют ультрацентрифугу для препаративных и аналитических целей, поскольку она дает возможность, расходуя очень небольшие количества вещества, определять многие его параметры и осуществлять очень тонкое фракционирование. Ультрацентрифугирование служит интересам специалистов самых различных областей. Так, биофизики с помощью ультрацентрифуги исследуют свойства взаимодействующих систем и используют вычислительную технику для решения соответствующих математических уравнений, когда-то слишком трудных для решения. Что же касается биологов, то благодаря ультрацентрифуге они получили возможность быстро решать вопрос о чистоте и размерах молекул только что выделенных активных препаратов. [c.13]

На конечной стадии очистки некоторые авторы использовали центрифугирование в градиенте сахарозы. Мори и Утсуми [83], как и Кэйзи [17], очищают этим способом легумины соответственно конских бобов и гороха. Однако для аналитических целей чаще применяется ультрацентрифугирование. Этот метод остается ценным средством для проверки чистоты образца и позволяет, кроме того, оценивать размеры молекул [17, 33, 47, 52, 85]. [c.155]

Для препаративного фракционирования лигнинов использовали электродиализ, ступенчатое извлечение из древесины, ступенчатое осаждение из растворов, элюирование из хроматографических колонок, а для аналитического фракционирования - ультрацентрифугирование, турбиди-метрическое титрование и эксклюзионную жидкостную хроматографию. При изучении молекулярно-массовых характеристик препаратов лигнина привлекались практически все методы определения молекулярной массы полимеров. [c.413]

Рис. 17.5. Шлирен-профиль липопротеинов плазмы крови человека при аналитическом ультрацентрифугировании (по А.Н. Климову и Н.Г. Никульчевой, 1995).

Остальные методы внутрифазного разделения или находят только технологическое применение, или их применение в химическом анализе о) раничено решением частных задач. Так, ультрацентрифугирование является одним из основных методов обогащения изотопов урана. Аналитическое применение ограничено фракционированием макромолекул органических веществ. Из сферы применения электрофореза в газовой фазе можно вспомнить улавливание взвешенных частиц из газовых потоков, в первую очередь, минеральных составляющих или частиц несгоревшего топлива в выбросах тепловьпс электростанций, котельных и т.п. [c.242]

Для экспериментального нахождения кривых ММР могут быть использованы> практически все методы препаративного фракционирования полимеров, позволяющие оценить молекулярную массу фракций, а также ряд транспортных методов — аналитическое ультрацентрифугирование, поступательная диффузия, экклюзион-ная хроматография, подробно описанные в литературе (см., например, [75]). [c.41]

К аналитическим методам фракционирования относятся ультрацентрифугирование и турбидиметрическое титрование. Турби-диметрический метод заключается в титровании раствора полй-молекулярного полимера осадителем в специальном приборе, называемом турбидиметром, и регистрации мутности системы. Раствор и осадитель должны находиться при одинаковой температуре. Увеличение мутности по мере прибавления осадителя может быть описано турбидимет-рической кривой (рис. 10.11). Такие кривые удобны для качественной оценки ширины молекулярно-массового распределения полимера, т. е, его полимолекулярности. Крутой подъем кривой характерен для полимера с узким молекулярно-массовым распределением. Пологие кривые свидетельствуют об очень большой полимолекулярности образца. На основании полученных данных можно вычислить массу осажденного полимера и его молекулярную массу и построить кривую молекулярно-массового распределения (см, стр. 418), Однако количественные результаты, полученные таким способом, ненадежны, и этот метод служит главным образом для качественного исследования полимолекулярности полимеров. [c.297]

Исследования проводились путем аналитического ультрацентрифугирования с использованием шлирен-оптики. А. Часть исходной популяции 808-рибооом диссоциирует, образуя 608- и 408-субъединицы. В. Добавление ионов магния к реакционной смеси, использованной в опыте А, приводит к почти полному исчезновению пиков, соответствующих 608- и 408-субъединицам [3]. [c.23]

А. Разделение путем аналитического ультрацентрифугирования (с использованием шлирен-оптики). Пик 1 соответствует 808-рибосомаи, пики г, 3, 4 а 5 соответствуют частицам, содержащим 2 рибосомы (коэффициент седиментации 1103), 3 рибосомы, 4 и 5 рибосом соответственно [1]. В. Отделение рибосом от полисом миксомицета путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Ник справа соответствует полисомам, в состав которых входит от 2 до 20 и более рибосом [26]. [c.26]

Баум и Джилберт [26], а также Фишер и Хил-перт [59 ] выделили из картофеля кристаллическую фосфорилазу были изучены ее химические и физические свойства [103]. Как показали исследования с помощью аналитического ультрацентрифугирования и электрофореза, этот фермент оказался гомогенным, его коэф- [c.148]

Впервые идея о применении значительной центробежной силы для осаждения и определения размеров коллоидных частиц была высказана и опробована на практике еще в 1913 г. Думан-ским. Однако потребовались долгие годы теоретических и практических изысканий, прежде чем Сведбергрм (1940 г.) были разработаны теоретические основы данного метода и создана первая ультрацентрифуга со скоростью вращения ротора до 65 ООО об1мин. К настоящему времени методы аналитического и препаративного ультрацентрифугирования получили широкое применение в исследованиях белков и нуклеиновых кислот и при изучении структурных элементов клетки. [c.142]

Приведем пример такого эксперимента. Изучение молекулярных свойств поли-п-бензамида (ППБА) ультрацентрифугированием было выполнено [78 ] в диметилацетамиде (ДМАА) с добавкой 3% ЫС1. Данный полимер растворяется также в концентрированной серной кислоте, но наблюдать седиментацию ППБА в ней практически невозможно. В то же время на стандартных диффузометрах исследование столь агрессивных жидкостей весьма затруднительно. Окатова, Деккер и один из авторов провели сравнительное изучение растворов ППБА в 96% Н2504 и ДМАА на аналитической ультрацентрифуге МОМ-3170 при частоте вращения ротора п = 10 ООО об/мин в кюветах со специально изготовленными вкладышами из фторопласта, однородного или наполненного коксом с добавкой двуокиси ванадия, устойчивыми к действию концентрированной Нг504. Одновременное вращение двух ячеек с использованием клиновидного окна позволило в одина- [c.42]

При описанном выше ультрацентрифугировании пики, наблюдаемые при помощи шлирен-системы, отвечают границам между раствором и растворителем. Первые, быстрые пики отвечают компонентам, движущимся в окружении более медленных компонентов (фиг. 8). В биохимических смесях некоторые из этих медленных компонентов (например, рибосомы при анализе бактериального экстракта) создают большую вязкость. Измеряемые коэффициенты седиментации могут при этом очень сильно отличаться от приведенного к стандартным условиям значения Поэтому полученные при помощи скоростной седиментации значения s не всегда можно непосредственно использовать при планировании и анализе данных препаративного зонального центрифугирования в градиентах плотности. При зональном ультрацентрифугировании анализируемая смесь наносится в виде слоя на раствор с увеличивающейся по направлению ко дну плотностью (что предотвращает конвекционное перемешивание) и различные компоненты седиментируют в градиенте плотности в виде отдельных зон. Для наслоения смеси можно использовать специальную аналитическую ячейку, в которой техника наслоения принципиально не отличается от обычного препаративного наслоения на градиент. Одна из таких ячеек (Be kman Instruments In .) приведена на фиг. 15. Преимущества применения такой ячейки, как отмечают Виноград и Брунер [11], состоят в том, что она требует меньше исследуемого материала, анализируемые компоненты в ней пространственно разобщены, медленные примеси отстают от быстрее движущихся зон и седиментацию последних можно осуществлять в любом растворителе, не прибегая к предварительному диализу. Растворитель должен быть более плотным по сравнению с [c.67]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология