Фермент-маркер

Один из подходов получил название метода гибридных антител . Ферментативным гидролизом получают РаЬ-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанолом при этом РаЬ-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент (рис. 19, а). Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клеткн, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями (рис. 19. б). [c.112]

Рис. 20. Схема связывания антител против антигена (Ад) и фермента-маркера (Е) с помощью антивидовых антител против Рс-фрагмента

После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию (или количество) меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, т. е. определить каталитическую активность фермента. Для этого в систему добавляют соответствующие субстраты фермента и измеряют скорость ферментативной реакции. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркера в системе. Очевидно, что для этого необходимо наличие пропорциональности между концентрацией фермента и измеряемой скоростью ферментативной реакции, т. е. выполнение соотношения [c.61]

К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют раствор определяемого антигена и раствор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и отмывки несвязавшихся с носителем компонентов определяют ферментативную активность на носителе. Метод является твердофазным, так как носитель с иммобилизованным антигеном используют на первой стадии анализа, включает лишь одну равновесную стадию инкубации, поэтому время анализа определяется в основном продолжительностью этой стадии, однако не дает возможности избежать контакта фермента-маркера с анализируемой средой. В связи с этим ограничения его применения могут возникать при необходимости анализа биологических жидкостей (сыворотка [c.95]

Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значи-гельном количестве, что осуществимо далеко не всегда. [c.100]

В отличие от конкурентного ИФА рассматриваемый метод основан на последовательном взаимодействии антител сначала с определяемым, а затем с меченным ферментом антигеном. Проведение аиализа возможно двумя путями. В первом случае меченый антиген добавляется непосредственно в инкубационную смесь, содержащую антитела и исследуемый образец. Во втором случае (возможном только при применении твердофазного ИФА) иммуносорбент после первой реакции отмывают от несвязавшихся компонентов, а затем вводят меченый антиген. В методическом плане второй путь часто предпочтительней, так как позволяет избежать возможное ингибирующее влияние компонентов исследуемой биологической жидкости на фермент-маркер (см. гл. 4, 2). [c.237]

При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, после чего проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и затем с конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом. Последний способ дает более четкую положительную реакцию, особенно если концентрация антигена в пробе очень мала, [c.119]

Оксидаза мочевой кислоты Специфические ферменты-маркеры отсутствуют Лактат-дегидрогеназа [c.15]

В методах иммуноанализа, основанных на использовании системы комплемента (рис. 9-1), антигены, такие, как теофиллин или тироксин, сначала иммобилизуют, т. е. присоединяют к поверхности липосом, содержащих фермент-маркер. Свободный антиген из образца конкурирует с иммобилизованным антигеном за связывание с антителами, причем для активации каскада реакций системы комплемента необходимо, чтобы два связавшихся антитела оказались в непосредственной близости [c.124]

Чистоту митохондриальной фракции можно определить различными методами по активности ферментов-маркеров, фазово-контрастной и электронной микроскопией. Биохимический контроль чистоты препарата основан на том, что из всех органоидов клетки только в митохондриях содержатся такие ферменты, как цитохромоксидаза или сукци- [c.154]

Определение активности ферментов-маркеров в полученных фракциях митохондриальных структур. Для [c.20]

В качестве маркеров применяют также ферменты. Основгшная на этом принципе специальная аппаратура для высокочувствительного ферментативного иммунохимического анализа выпускается серийно. В этом случае определяемый компонент метят ферментом. С антителами взаимодействуют как свободные, так и связанные с ферментом соединения, причем активность фермента при образовании комплексов АГ-АТ. как правило, подавляется (иногда усиливается). Концентрацию исследуемого вещества определяют путем измерения активности фермента по отношению к соответствующему субстрату. Чем больше концентрация немаркированного соединения, тем меньше фермента связьшается антителами и тем выше его активность. При этом достигается высокая чувствительность определений, характерная для ферментативных методов анализа. Использование ферментов-маркеров для контроля за ходом иммунохими- [c.299]

Наибольшее распространение получили методы введения ферментной метки, основанные на образовании ковалентной связи между молекулами антитела и фермента. Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов окислением углеводного компонента фермента перйодатом натрия. В случае использования щелочной фосфатазы в качестве фермента-маркера применяют глутаровый альдегид, взаимодействующий с е-аминогруп-пами белковых молекул. [c.317]

В тех случаях, когда требуется определить, какая именно часть эукариотического гена ответственна за регулирование его экспрессии, предполагаемые регуляторные последовательности ДНК этого геиа можно присоедииить к кодирующей последовательности другого гена, выбранного с гаким расчетом, чтобы в нем был закодирован какой-нибудь легко обнаруживаемый фермент-маркер, в норме в эукариотических клетках отсутствующий. Чаще всего в качестве такого фермеита-маркера используется бактериальный белок хлорамфеникол-ацетил-трансфераза (ХАТ) Полученную рекомбинантную молекулу ДНК вводят в эукариотическую клетку, чтобы выяснить, действительно ли предполагаемые регуляторные последовательности стимулируют экспрессию геиа ХАТ. Проще всего сделать это, если трансфицировать [c.337]

В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в иммунофермент-ном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты. Во многих случаях, когда необходим качественный результат, оценка иммунохимической реакции может быть проведена визуально. [c.108]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

В заключение раздела еще раз подчеркнем, что основными достоинствами гетерогенных методов ИФА является высокая чувствительность, возможность определения соединений с различной молекулярной массой (от гаптенов до целых к- еток), возможность анализа образцов, содержащих ингибиторы и активаторы фермента-маркера. Развивающиеся в настоящее время кинетические методы твердофазного ИФА, а также ИФА на основе водорастворимых полимеров открывают возможность экспресс -айализа исследуемых веществ. [c.114]

Заслуживает внимания еще один подход, когда в качестве маркеров антигена или антитела используют ферменты, катализирующие реакции с образованием АТР и NAD. Использование биолюминесцентных систем для регистрации генерируемого в процессе реакции кофактора значительно повышает чувствительность определения фермента-маркера и, следовательно, чувствительность соответствующего метода анализа. Общая схема детектирующей системы может быть представлена следующим образом [c.131]

Иммуноферментный анализ, возникший более пятнадцати лет назад на пересечении иммунохимии и инженерной энзимо-логии, стал в настоящее время одним из распространенных методов исследования. Явные преимущества нового метода, к которым относится простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, обеспечили его прочное положение в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях. Благодаря успехам биотехнологии иммуноферментный анализ далее интенсивно развивался, поскольку с помощью генной инженерии были получены в высокоочищенном виде малодоступные антигены, а также ферменты-маркеры и их конъюгаты с антигенами, а с помощью клеточной инженерии — моноклональные антитела с заданной специфичностью и аффинностью. Новые направления развития иммуноферментного анализа связаны с использованием различных методов регуляции ферментативной активности при детектировании комплексов антиген — антитело. Именно этим вопросам и посвящена предлагаемая книга. [c.5]

Чистоту препаратов плазматических мембран проверяют в электронном микроскопе и по наличию активности ферментов-маркеров (АТФ-азы и 5 -нуклеотидазы). Загрязненность изолированных плазматических мембран микросомами контролируют по присутствию глюкозо-б-фосфатазы, митохондриями — по наличию сукцинатде- [c.328]

Какова функция мембранно-связанных ферментов на примере Ка+, К+ —АТФ-азы 2. Назовите маркерные ферменты а) длн плазматических мембран б) для митохондрий в) для ядер г) для микросом. 3. Какие требования предъявляются к ферментам-маркерам 4. Чем могут быть обусловлены артефакты при определении маркерных ферментов плазмати сских мембран 5. Примеси каких оргаиелл присутствуют во фракции плазматических мембран 6. На чем основано определение активности Na+, К+ — АТФ-азы, 5 -нуклеотидазы, щелочной фосфатазы [c.244]

К маркерным ферментам эндоплазматического ретикулума клеток печени относят глюкозо-6-фосфатазу, многие ферменты системы переноса электронов. В других тканях обнаружены незначительные количества глюкозо-6-фосфа-тазы, в связи с чем используют другие ферменты-маркеры для определения чистоты фракции (см. табл. 1). Кроме того, при определении глюкозо-6-фосфатазы могут возникнуть артефакты из-за активности кислой и щелочной фосфатаз, для чего необходимо применять их ингибиторы (фтористые соединения, ЭДТА). [c.244]

Антигены и антитела. До сих пор не описано каких-либо серийных биосенсорных систем для определения антигенов и антител. В разработанных недавно ферментных иммуносенсорах измеряют активность ферментов-маркеров, связанных с определенным количеством антигена. Содержащий маркер антиген и немеченый определяемый антиген конкурируют между собой за связывание с определенными сайтами антител на мембране, покрывающей электрод. Неизвестная концентрация немеченого антигена обратно пропорциональна измеряемой электродом активности фермента-маркера. Однако в настоящее время чувствительность этого метода низка по [c.274]

В настоящее время, по-видимому, единственный практический способ устранения их недостатков-это разработка методов электрохимического иммуноферментного [ализа, как потенциометрических, так и амперометрических. Образование комплекса [тиген - антитело проводят вне сенсорной системы. После завершения инкубационно- периода добавляют субстрат фермента-маркера и с помощью сенсора следят за оростью превращения субстрата, используя щелочную фосфатазу в качестве фер- нта-маркера, глюкозо-6-фосфат как субстрат и сенсор глюкозы. При помощи lukometer можно определить от 1,6 до 16 нг фактора VIII, связанного с антигеном в 1азме крови человека [52]. [c.275]

Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы — маркерами лизосом, каталаза — маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза — маркером мембран микросом. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р-глюкуронидаза, НАДФ Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органел-лами или он ингибируется или инактивируется поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров. [c.56]

Определение чистоты и качества иолученного препарата митохондрий. Определение чистоты и качества полученной фракции митохондрий можно проводить различными путями 1) по величинам дыхательного контроля по Чансу - Вилльямсу (ДК) и отношения АДФ/0 2) путем определения ферментативной активности фракции (по наличию активности ферментов-маркеров митохондрий и отсутствию активности ферментов-маркеров, свидетельствующих о наличии немитохондриальных компонентов) [c.17]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология