Барназа

Разработанный Ферштом эмпирический подход к изучению термодинамических и кинетических аспектов свертывания белковой цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил автору и сотрудникам проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка (барназы), не содержащего дисульфидных связей [31-33]. Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания. Следующий этап заключается в модификации потенциально важных для сборки межостаточных взаимодействий путем специальных химических изменений белковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Завершается этап составлением оптимального набора и его синтеза методами генной инженерии. Далее проводятся термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов, определения констант равновесия, констант скорости и величин изменений свободной энергии Гиббса стабильных структур, промежуточных и переходных состояний. Найденные значения используются для построения энергетических профилей путей свертывания белковых цепей дикого и мутантного типов. На их основе определяются разностные энергетические диаграммы, которые показывают различия в уровнях энергии всех состояний на пути свертывания белка и мутантов. Реализация описанной процедуры приводит к эмпирическим зависимостям между важными для свертывания белковой цепи взаимодействиями боковых цепей и параметрами, по мысли Фершта, характеризующими кинетику, равновесное состояние и механизм ренатурации [И]. Каждая мутация, которая в [c.87]

Исследование процесса ренатурации барназы Ферштом и соавт. [31-33] (как и панкреатического трипсинового и ингибитора Крейтоном [29, 30]) подробно изложено во втором томе издания "Проблема белка" [2. Ч. III]. Анализ результатов привел к заключению, что первая попытка воссоздать на уровне отдельных аминокислотных остатков количественную картину всего пути свертывания белка, не содержащего дисульфидные связи, не достигла желаемой цели. Декларированный Ферштом порядок ренатурации не является неизбежным следствием объективного рассмотрения, а представляет собой один из многих правдоподобных вариантов. Принципиальное возражение заключается в несоответствии равновесной термодинамики и формальной кинетики - теоретической основы эмпирического подхода Фершта - сугубо неравновесному характеру процесса структурной самоорганизации белка. [c.88]

Сравнение кинетики сворачивания родственных блоков, полученных методом генной инженерии и отличающихся между собой аминокислотным составом боковых цепей, позволяет подойти к определению структуры промежуточных состояний при сворачивании. Незначительные изменения в боковых цепях белка мутантов не нарушают общей картины сворачивания, но выявляют роль определенных взаимодействий в этом процессе. Анализ более 120 мутантов, включающих изменение более половины боковых цепей барназы (РНК-аза белок со 110-ю остатками), подтвердил определяюшую роль гидрофобных взаимодействий в стабилизации зародышей вторичной и третичной структуры (Фершт, 1993). По-видимому сворачивание в барназе начинается на N-кoнцe, образующем а-спирали, и центральной -шпильке, которые затем притягиваются и стабилизируются гидрофобным взаимодействием. При сохранении общего направления сворачивания основной последовательности возможны небольшие различия в структуре интермедиатов, отражающие роль боковых цепей. В целом становится ясным, что в белках вторичная структура служит блоком при формировании третичной структуры и должна поэтому быстро образовываться и быть относительно стабильной, чтобы прожить достаточно долго. Начало формирования третичной структуры связано с образованием инициирующей шпильки из соседних по цепи сегментов. Это требует фиксации структуры двух структурных сегментов и большой затраты энергии и поэтому невыгодно с энергетической точки зрения. [c.214]

Рис. 111.17. Схематическое представление трехмерной структуры барназы [ПО, 143]

Барназа, по классификации М. Левитта и С. Чотиа, относится к группе белков a+ [150]. Половина структуры со стороны N-конца последовательности содержит три а-спирали, образованные остатками [c.393]

Наиболее сильное стабилизирующее воздействие на формирование структуры барназы оказывает, очевидно, нуклеация Nu lj (рис. III. 18). В нее входят боковые цепи 13 остатков, шесть из которых располагаются в N-концевой части последовательности, а остальные — в С-концевой (табл. III. 1). Боковая цепь Пе-88, находящаяся в центре нуклеации и взаимодействующая практически со всеми ее боковыми цепями, по-видимому, является цементирующей структуру Nu l]. Можно полагать, что назначение Nu li в процессе свертывания заключается в связывании противоположных участков белковой цепи, чему должно предшествовать структурирование спирали О] и складчатых листов i, [c.393]

Отобранная совокупность объектов дальнейшего исследования составила 64 мутанта, из которых 59 отличались от дикого типа барназы одним остатком, четыре — двумя и один — тремя. Замещение произведено не только в местах скопления гидрофобных остатков (Nu l, 3), но и во всех других областях трехмерной структуры. Далеко не всегда это были замены остатков с более объемными алифатическими боковыми цепями на менее объемные, типа Пе на Val или Val на Ala. Часто мутировались остатки, несущие положительные (Arg, Lys) и отрицательные (Asp, Glu) целочисленные заряды, соответственно на Gly, Ala и Ala, Gly, Asn, а также остатки с гидроксильными группами (Thr, Ser, Tyr) на Gly, Ala, Val, Arg, Phe. Почти во всех экспериментах денатурация белковой цепи проводилась под действием мочевины. Многие исследования показали, что свободная энергия развертывания в этом случае изменяется пропорционально концентрации денатуранта [(H2N)2 O] и может быть определена по формуле [c.396]

Напомним, что идея исследования стабильности пространственной структуры барназы заключалась в предположении, что при минимальном сокращении боковой цепи того или иного остатка происшедшее вследствие этого увеличение свободной энергии (AAGp) обусловлено потерей стабилизирующего вклада невалентных взаимодействий именно той атомной группы, которая исчезла в мутанте. А. Фершт, излагая основы своего метода, в частности, пишет [c.396]

Изменения свободной энергии развертывания под действием мочевины белковой цепи барназы при замене остатков Asp и Ser на Ala [c.398]

В табл. Ш.З сопоставлены величины АДОр, полученные при заменах остатков Asp и Ser барназы, способных образовывать эффективные электростатические контакты и водородные связи, на остаток Ala, лишенный таких возможностей. Полученные Ферштом и соавт. [137] результаты мутаций столь различны, что вряд ли по ним можно сказать что-либо определенное о роли боковых цепей аспарагиновой кислоты и серина в стабилизации трехмерной структуры белка. [c.398]

Например, замены в последовательности барназы Thr-16 на Arg и Lys-27 на Gly изменяют свободную энергию Гиббса всего на —0,5 и 0,4 ккал/моль, в то время как при заменах Thr-6 на Ala и Glu-29 на Gly изменения составляют 2,1 и 1,8 ккал/моль. Следовательно, и здесь энергия межостаточных невалентных взаимодействий не может быть представлена аддитивной суммой неизменяющихся парциальных вкладов. [c.398]

Таким образом, имеющиеся экспериментальные данные о различиях в свободной энергии нативной барназы и ее мутантов про-398 [c.398]

Перейдем теперь к рассмотрению результатов исследования Фершта и соавт. [138, 139] кинетики свертывания и развертывания барназы и ее мутантов. [c.400]

Ранее, при изучении денатурации барназы был сделан вывод, что по ходу своего развертывания белковая цепь сначала преодолевает переходное состояние, определяющее скорость процесса при всех концентрациях денатуранта (мочевины), а затем последовательно принимает ряд промежуточных форм, из которых идентифицировать удается лишь одну (1) [131]. Поэтому минимальная кинетическая схема, согласующаяся с существующими опытными данными, имеет вид [c.400]

Рис. 111.21. Изменение свободной энергии при свертывании белковой цепи барназы (концентрация мочевины <4 М), развертывании (>4 М) и в состоянии равновесия (4 М)

Разности изменений свободной энергии (ккал/моль) промежуточных (I), переходных (Т8) и полностью свернутых (М) состояний мутантов относительно денатурированных (О) по сравнению со свободной энергией барназы (ДДСи 1, ДДСп 1-8, ДДСр ) н значения структурных параметров ф] и при развертывании белковой цепи [139] [c.403]

Примечание. Вт.щслеиы аминокислотные остатки, конформации которых в промежуточном (I) и переходном (Т5) состояниях бли )ки конформациям в свернутой структуре барназы. [c.403]

Итак, первая попытка построить на уровне отдельных аминокислотных остатков количественную картину всего пути свертывания белковой цепи не достигла желаемой цели. Декларированный Ферштом и сотрудниками порядок ренатурации барназы не является очевидным следствием беспристрастного анализа, а представляется одним из множества правдоподобных вариантов феноменологического описания процесса. Для такого заключения имеется ряд причин как субъективного, так и объективного характера. Прежде всего, невозможно было дать однозначную трактовку всем этапам свертывания белка из-за ограниченного при решении столь сложной задачи набора структурных параметров ф. В самом деле, для описания поведения цепи из ПО аминокислотных остатков авторы ничего не знали о более чем 80% остатков и располагали количественной информацией только о четырех остатках в состоянии I и семи остатках, куда вошли предшествующие четыре, в состоянии TS. Из 33 изученных мутантов лишь у четырех значения параметра ф заметно отличаются от фхх. Поэтому трудно говорить определенно о динамике ренатурации белка на участке I TS. Метод не фиксирует происходящие здесь события. Очевидно, при таком соотношении числа известных и неизвестных может быть написано много сюжетов укладки барназы. [c.405]

Проблема белка (1997) -- [ c.87 ]

Проблема белка (1996) -- [ c.392 , c.393 , c.394 , c.395 , c.396 , c.397 , c.398 , c.399 , c.400 , c.401 , c.402 , c.403 , c.404 ]

Проблема белка Т.3 (1997) -- [ c.87 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.416 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология