Ионообменная хроматография белков

Эта область ионообменной хроматографии белков наиболее обширна. Сделаем попытку систематизации используемых здесь приемов, разделив их на шесть групп. Но прежде всего заметим, что постановке хроматографического опыта в любом случае должна предшествовать отработка метода идентификации очищаемого белка (путем обнаружения ферментативной активности или других биоло- [c.302]

ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ [c.21]

Основу руководства составили работы, которые на протяжении ряда лет используются в учебном процессе на кафедре биохимии 1 ММИ им. И. М. Сеченова. В практикум включены работы, знакомящие студентов с современными методами исследования и проблемами биохимии, такими, как электрофорез белков в полиакриламидном геле, ионообменная хроматография белков, гель-фильтрация, изучение четвертичной структуры белков и др. Подобраны и приспособлены к условиям работы в студенческой лаборатории современные методы выделения и изучения ферментов, их количественного определения в биологических жидкостях и тканях. Авторы стремились по возможности использовать в качестве объектов изучения биологические материалы, с которыми обычно имеет дело клиническая биохимия. [c.3]

Б. Область рн при ионообменной хроматографии белков [c.431]

Систематические поиски обратимых ионообменных сорбентов привели к выбору карбоксильной смолы Амберлит ШС-50 как наилучшего среди синтетических ионитов материала для колоночной ионообменной хроматографии белков. Впервые колонки с этой смолой были использованы для очистки цитохрома С [12]. [c.199]

Уже давно для очистки белков и их разделения применяли методы, основанные на неодинаковом сродстве белков к некоторым адсорбентам. В последнее время это направление получило дальнейшее развитие в адсорбционной хроматографии белков. Примером может служить хроматография белковых смесей на колонках из гидроксилапатита (Са5(Р04) зОН). Однако наибольшее развитие и практическое применение получила ионообменная хроматография белков, которая и будет здесь рассмотрена. [c.26]

Ионообменная хроматография белков при всех своих достоинствах обладает и серьезными недостатками. Многие белки неполностью элюируются с ионообменника, что ведет иногда к существенным потерям. Ряд лабильных белков денатурируется при взаимодействии с ионообменником, как полагают, в результате взаимодействия углеводородных радикалов с матрицей ионообменника и развертывания пептидных цепей, составляющих белковую молекулу. Поэтому наилучщие результаты дает обычно хроматографическое разделение относительно устойчивых низкомолекулярных белков. [c.29]

Для проведения ионообменной хроматографии белков наиболее подходящими носителями оказались катиониты и аниониты на основе целлюлозы. По сравнению с синтетическими ионообменными смолами (например, полистирольными смолами тина дауэкс и амберлит) они обладают исключительно большой емкостью по отношению к белкам. Широко [c.19]

Механизм ионообменной хроматографии белков представлен на рис. 10. [c.30]

Дальнейшую очистку ферментного препарата, содержащего в небольших количествах примеси белков, сходных по физико-химическим свойствам с ферментом, ведут методом ионообменной хроматографии. Белки в ионообменном процессе взаимодействуют с ионитом и при помощи электростатического взаимодействия связываются с его поверхностью. Для элюирования белков с поверхности ионита используют изменение концентрации при pH пропускаемого через ионит буфера или введение нейтральных солей (ЫаС1, КС1). [c.203]

У большей части белков в процессе хроматографии сразу происходит изменение величины К[От О до 1.Это вызвано тем, что белки либо прочно сорбируются на ионообменнике, либо выходят с элюирующим буферным раствором, поскольку происходит одновременная взаимная нейтрализация многочисленных реакций взаимодействия между белком и ионообменником при данных pH и ионной силе раствора. Поэтому важно тщательно подбирать буферный раствор для ионообменной хроматографии белка. Ионообменную колонку обычно загружают при низкой ионной силе раствора. Для катионообменника оптимальная величина pH равна 4—5, для анио-нообменника 7—8- Элюирование с колонки катионообменника происходит при увеличении pH буферного раствора, а с колонки анионо-обменника — при уменьшении pH. В том и другом случае с изменением pH можно увеличивать ионную силу. Изменение pH и ионной силы элюирующего буферного раствора можно производить поэтапно (ступенчатое элюирование) или непрерывно (градиентное элюирование). [c.22]

Ионообменная хроматография на колонках с ионитами основана на обмене ионов данного вещества с подвижными ионами ионита. Для ионообменной хроматографии белков и других биологических веществ применяются синтетические ионообменные смолы и иониты на целлюлозной основе — целлюлозонониты. [c.124]

Метод ионообменной хроматографии белков с использованием ионитов на целлюлозной основе был предложен Петерсоном и Собером. Целлюлозоиониты обладают высокой разделяющей способностью, низкомолекулярные вещества почти не сорбируются на целлюлозо-ионитах, а белки на колонках не повреждаются и их выход часто достигает 100%. Целлюлозоиониты синтезируют путем химической модификации целлюлозы они имеют высокую емкость для белков и могут быть получены с любой желаемой ионообменной характеристикой. [c.55]

В настоящее время в ионообменной хроматографии белков и ферментов применяются почти исключительно эти производные. Недавно для тех же целей были синтезированы ионообменные производные агарозы (см. табл. 5.6). Структура матриц этих ионов такова, что в нее легко проникают даже крупные макромолекулы, благодаря чему в ионном обмене участвуют группы, расположенные внутри зерен ионита. Теоретические основы хроматографии белков на ионитах рассматриваются Ти-зелиусом ([211]. В ряде статей и монографий (некоторые из них указаны в табл. 5.13) описаны методы сорбции на ионитах и методы хроматографии белков. В большинстве случаев для хроматографии белков применяют DEAE-целлюлозу. После по- [c.316]

Ионообменную хроматографию белков [20] выполняют на ионообменниках, имеющих гидрофильную матрицу, например на целлюлозе и декстране. Анионообменники, особенно ОЕАЕ-целлюлозу и ОЕАЕ-сефадекс, используют чаще, чем катионооб-менники типа СМ-целлюлозы. Ионообменники на основе целлюлозы имеют открытую сетчатую структуру с ионизованными центрами, легкодоступными для белков. Число ионных связей, образующихся между обменником и белком, зависит не только от используемого материала, но также в большой степени от pH и ионной силы буфера. Эти ионные пары постоянно диссоциируют и образуются вновь, так как ионы элюента конкурируют за центры обмена. Обменники, пригодные для фракционирования белков, имеют низкую плотность зарядов, поэтому число ионных связей между ионитом и отдельными молекулами белка не столь велико, чтобы вообще воспрепятствовать продвижению последних вдоль колонки. Хотя ионные связи постоянно диссоциируют и образуются вновь, в начале хроматографирования белок связывается с ионообменником и не элюируется с колонки. Однако когда концентрация небольших конкурирующих ионов буфера возрастает до такого уровня, что все связи одновременно разрываются, белок начинает двигаться вниз по колонке. Если в процессе разделения используют градиент ионной силы, белок, перемещающийся в стартовой зоне медленнее, чем буфер, элюируется им при увеличении концентрации ионов. Таким образом, элюирующая способность буферного раствора постоянно увеличивается и макромолекула перемещается все быстрее и быстрее. Скорость ее перемещения становится сравнимой со скоростью движения жидкости, когда в элюенте достигается такая концентрация соли, которая эффективно препятствует взаимодействию молекулы белка с обменником. Важное значение в каждом отдельном случае имеет профиль градиента чтобы увеличить разрешение пиков в определенных участках хроматограммы, используемый градиент должен быть сравнительно пологим, но в то же время достаточно крутым в других участках, чтобы избежать уширения пиков. [c.108]