Белки адсорбционная хроматография

Влияние на адсорбцию полимеров химии поверхности адсорбента и природы растворителя. Влияние на адсорбцию полимеров размеров пор адсорбента. Адсорбция из растворов и адсорбционная хроматография олигомеров. Адсорбционная и ситовая хроматография полимеров. Адсорбция и хроматография белков и вирусов. [c.332]

Многократное повторение актов адсорбции и десорбции при течении раствора через слой адсорбента приводит к отставанию наиболее поверхностно-активных компонентов, что позволяет определить их содержание в исходном растворе или отделить их от других, менее адсорбционно-активных веществ. Методы адсорбционной хроматографии широко применяются для фракционирования аминокислот, нуклеиновых кислот, белков и других биополимеров, для выделения различных ферментов и лекарственных препаратов (пенициллина, тетрациклина, алкалоидов и др.). [c.93]

Использование высокой сорбционной способности стекла (в виде гранул пористого стекла) для адсорбционной хроматографии белков, нуклеиновых кислот и их компонентов оказалось, вопреки первоначальным ожиданиям, делом малоперспективным из-за тех же трудностей, связанных с плохой воспроизводимостью и необратимостью сорбцией. [c.224]

Адсорбционную хроматографию на угле, крахмале и других классических сорбентах вообще не применяют для разделения пептидов. Этот метод представлен здесь аффинной хроматографией, основанной на биоспецифической сорбции. Правда, аффинную хроматографию в основном применяют при выделении белков, однако метод может оказаться полезным при изучении физиологически активных пептидов. [c.390]

ДНК отделяют от РНК, высших олигонуклеотидов и белка методом адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите, метилированном альбумине-f-кизельгур (МАК), полилизине+ + кизельгур (ПЛК) или нитроцеллюлозе. Эти же сорбенты с успехом применяют для разделения нативной (двунитевой) и денатурированной (однонитевой) ДНК. [c.69]

Адсорбционная хроматография. Избирательное адсорбирование белков некоторыми материалами и последующая их избирательная элюция часто используются для очистки белков. Такое фракционирование может проводиться как па колонках, так и на пластинках адсорбента. Для адсорбционной хроматографии белков применяют обычно такие носители, как гель фосфата кальция, алюмогель, диатомовая земля (целит), крахмал г гидроксилапатит. [c.80]

Трудно переоценить значение методов разделения. Без них немыслима работа в обширных отраслях химии. Например, если бы не существовало бумажной и ионообменной хроматографии и электрофореза, то химия белков и нуклеиновых кислот, химия протеинов и соответствующая область молекулярной биологии едва ли достигли бы современного уровня развития. Методы противоточного распределения очень облегчили изучение антибиотиков, полипептидов и других соединений, а также позволили разделить многочисленные синтетические смеси. Без адсорбционной хроматографии нельзя себе представить современную химию природных соединений (витаминов, терпенов, стероидных гормонов и т. д.). Газовая хроматография — один из методов контроля, наиболее широко применяемый в промышленном крупнотоннажном органическом синтезе. Современные методы разделения используются не только в препаративных, но и в аналитических целях, а также в промышленности. Все эти методы интенсивно развиваются. В настоящее время точность и скорость разделения методами газовой и жидкостной [c.12]

Уже давно для очистки белков и их разделения применяли методы, основанные на неодинаковом сродстве белков к некоторым адсорбентам. В последнее время это направление получило дальнейшее развитие в адсорбционной хроматографии белков. Примером может служить хроматография белковых смесей на колонках из гидроксилапатита (Са5(Р04) зОН). Однако наибольшее развитие и практическое применение получила ионообменная хроматография белков, которая и будет здесь рассмотрена. [c.26]

При использовании метода адсорбционной хроматографии для разделения белков наиболее приемлемыми адсорбентами оказались различные модификации фосфата кальция, в особенности оксиапатит [35—38]. Недостатком этого метода является получение размытых хроматограмм, что обусловлено характером изотермы адсорбции. Кривая зависимости количества адсорбированного белка от его концентрации в подвижной фазе имеет резкий излом вблизи насыщающей концентрации белка в подвижной фазе. По мере продвижения белка вниз по колонке хвост , содержащий небольшое количество вещества, удержи- [c.110]

Оси. работы посвящены исследованию адсорбции и электрофореза. Создал (1931 —1935) метод фронтальной адсорбционной хроматографии, с помощью которого смог анализировать качественно и количественно смеси, содержащие аминокислоты, пептиды, углеводы. В результате проведенных им (с 1935) исследований электрофореза разработал метод электрофоретического анализа биоколлоидов с его различными модификациями (микроэлектрофорез, электрофорез на бумаге, иммуноэлектрофорез). Применил электрофоретический метод для решения ряда прикладных задач биохимии — исследования и разделения нормальной и патологической сывороток, изучения чистых белков и их смесей, ферментов, нуклеопротеидов, нуклеиновых и аминокислот и др. С помощью иммуноэлектрофореза заложил основы изучения белковой структуры нормальной сыворотки крови, выделив из нее три различных белка (теперь их обнаружено более 20). [c.428]

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае фе рментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции в объеме , так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков. [c.91]

Рис. 4.32. Основной принцип аффинной адсорбционной хроматографии. Лиганд Ь ковалентно присоединен к цепи носителя. Адсорбент связывает только молекулы фермента Е, обладающего специфическим сродством к Ь. Белки Р проходят через колонку, не связываясь с адсорбентом.

Теорию, изложенную в разд. 4.1, можно применить к адсорбционной хроматографии и сделать при этом некоторые интересные выводы. Поскольку константа диссоциации комплекса адсорбента с белком (Кр) должна быть близка к константе диссоциации комплекса белка с лигандом или каки.м-то образом связана с ней, можно легко рассчитать величину коэффициента распределения. Один из недостатков аффинных адсорбентов заключается в том, что, хотя степень модификации может быть достаточно высокой (1—10 мкмоль-см ), только незначительная часть иммобилизованного лиганда оказывается ориентированной должным образом даже при наличии удлиняющего мостика обычно только 1—2% общего числа центров связывают белок. Хорошей считается емкость в 1—2 мг-см что для белка с мол. массой 100000 соответствует величине /п/ от 0,01 до 0,02 мМ. Если допустить, что равно 0,02, а рг — 0,01 в уравнении (4.5), то можно вычислить величины а для различных значений Кр, данных в табл. 4.7. [c.153]

Несколько неожиданным результатом является то, что для хорошей адсорбции (а>0,9) величина Кр должна быть ниже 0,001 мМ или 10 М, т. е. меньше, чем обычные константы диссоциации для комплексов белок—лиганд. Если учесть, что специфическое взаимодействие белка с иммобилизованным в колонке лигандом, вероятно, слабее, чем его взаимодействие со свободным лигандом, то естественно возникает вопрос, каким же образом осуществляется аффинная адсорбционная хроматография. [c.153]

К другим методам элюции относятся изменение температуры (снижение температуры ослабляет гидрофобные взаимодействия), разведение буфера, даже промывка водой (разд. 4.7) и электрофорез для удаления заряженных белков с колонки [87]. В заключение следует сказать, что аффинная адсорбционная хроматография является великолепным методом, если вся процедура уже тщательно отработана, однако подбор или создание необходимых адсорбентов может быть очень трудоемким процессом. [c.162]

Подбором структуры нор и химии поверхности адсорбента, а также оптимальных условий элюирования можно осуществить концентрирование и очистку биополимеров методами адсорбционной и (или) ситовой хроматографии. В последнем случае крайне важно устранить сильную адсорбцию белков и вирусов на внешней поверхности макропористых зерен. [c.343]

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Адсорбционная (жидкостная) хроматография находит широкое применение для разделения белков. При этом методе адсорбция фракционируемых соединений на сорбенте происходит под действием межмо-лекулярных сил. [c.114]

В специализированной области хроматографического разделения биохимических веществ накопление получаемых данных, без сомнения, будет постоянно продолжаться, что должно привести к более детальной картине адсорбции на кремнеземе веществ с высокими молекулярными массами. Серьезную проблему, однако, представляет собой денатурация белков, когда скрученные в спирали и связанные водородными связями белковые конфигурации разрываются под действием сил, стремящихся распрямить молекулы вдоль поверхности. С целью определения молекулярных размеров полимерных молекул методом эксклюзивной хроматографии кремнезем следует сформировать в виде совершенных структур с регулируемым размером пор [443]. Однако при таком использовании адсорбции полимеров на поверхности кремнезема необходимо избегать некоторых нежелательных моментов, и, кроме того, еще нет полностью удовлетворительного способа, пригодного для модифицирования поверхности, чтобы сделать ее инертной по отношению ко всем адсорбционным силам. [c.981]

Окись магния, силикаты магния (например, Florisil ), карбонат кальция, а также полистирол и полиамиды имеют свои области применения в адсорбционной хроматографии, главным образом в неполярных растворителях, но в процессах очистки и фракционирования белков и НК они практически не используются. [c.224]

Мы привели довольно длинный список широко известных ад- opGeirroB, которые не используются в интересующих нас хроматографических методах очистки и фракционпрования биополимеров, для того чтобы освободить подход к практически единственному варианту адсорбционной хроматографии, который широко и плодотворно применяется для этой цели. Речь идет о хроматографии белков и НК на оксиапатите. [c.224]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Из большого числа поверхностно-активных веществ, пригодных в качестве сорбентов при адсорбционной хроматографии, в белковой химии широкое применение получили гели фосфата кальция. В настоящее время в хроматографии белков чаще используют особую форму фосфата кальция—гидроксилапатит (Са50Н(Р04)з). Эта форма более устойчива в широкой области pH и обладает большей стабильностью. Гидроксилапатит готовят смешиванием растворов хлористого кальция и двузамещенного фосфата натрия. Образующийся осадок двузамещен-ного фосфата кальция под действием концентрированной щелочи гидролизуется в новую разновидность фосфата кальция — гидроксилапатит. [c.114]

Большую помощь в работе по изучению продуктов расщепления белка и их последующих превращений в организме оказывают современные методы физико-химического анализа метод п р о -тивоточного распределения в системе двух нес-мешивающихся растворителей, метод адсорбционной хроматографии, метод распределительной хроматографии на бумаге, метод электрофореза на бумаге и другие. Последние два метода, позволяющие работать с очень малыми количествами исследуемого вещества, получают все более широкое применение в клинических лабораториях. [c.247]

Кривые элюирования, полученные на колонке такого типа, требуют тщательной расшифровки, поскольку механизм процесса, лежащего в основе такого метода, отличается от механизма распределительной и ионообменной хроматографии. В процессе адсорбционной хроматографии встречается значительное размывание вытекающих зон (образование хвостов ), за исключением тех случаев, когда состав элюирующего раствора таков, что значение вымываемого вещества приближается к единице. Успех фракционирования смеси белков зависит от подбора таких концентраций буферного раствора, которые достаточно различаются по ионной силе, чтобы обеспечить четкое разделение компонентов смеси на фракции при элюировании их с колонки. Во многих случаях последовательное элюирование белков проходит без помех, но необходимо помнить, что пики, полученные из смеси неизвестных белков, могут содержать несколько белков в каждой элюируемой зоне. Наряду с этим можно ожидать, что один белок, обладающий сильно изогнутой изотермой, будет давать отдельный пик при каждом приращении ионной силы в более широкой зоне элюирования. Адсорбционную хроматографию легко спутать с другими формами хроматографии. Наилучшим критерием первого механизма является отсутствие пропорциональности между длиной колонки и абсолютным положением пика на кривой элюирования. В случае истинного распределительного или ионообменного механизма разделения объемы элюирования данного растворенного вещества прямо пропорциональны длине колонки. [c.224]

Адсорбционная хроматография основывается на различной способности молекул смеси адсорбироваться на поверхности носителя (силикагель, окись алюминия, активированный уголь) при пропускании через него подвижной фазы. Принцип метода ионообменной хроматографии — разновидности адсорбционной хроматографии — заключается в способности ионообменника (отрицательно заряженного катионита или положительно заряженного анионита) обратимо адсорбировать заряженные молекулы при определенных значениях pH. Мембранные белки и углеводы разделяют на ионнообменниках на основе целлюлозы, декстрана, полиакриламида. [c.220]

На колонках, предназначенных для гель-фнльтрацин, можно работать в режиме распределительной или адсорбционной хроматографии. При этом неполнота модификации носителя используется для сорбции белка. Ниже обсул дается разделение белков рассмотренными методами. [c.207]

При обратнофазовой хроматографии водная (полярная) фаза подвижна, а органическая (неполярная) неподвижна. Это противоположно тому, что мы имеем в классиче кой адсорбционной хроматографии. Чтобы сделать органическую фазу стационарной, органические группы ковалеитио связывают с твердым носителем, однородным по в лич)ше частиц (обычно били 10 мкм). Чаще всего в качестве стационарной фазы используют насыщенную углеводородную цепь с 18 атомами углерода, присоединенную к частицам двуокиси кремния. Этот продукт обозначают как С-18, RP-18 илн ODS (октадецилсилаи). Имеются также носители с прикрепленными к SIOi цепями из 8 или 2 углеродных атомов, обозначаемые как RP-8 или С-8 и RP-2 или С-2 соответственно. Дать совет, какую следует выбирать стационарную фазу, затруднительно, так как в каждом конкретном случае этот вопрос решается эмпирически однако следует отметить, что длинные углеводородные цепи связывают белки прочнее, чем короткие. [c.102]

Метод основан на способности кининогена как белка с низкой изоэлектрической точкой, pHi 3,15—3,5 (Т. Л. Егорова, Т. С. Пасхина, 1967), избирательно связываться с ДЭАЭ-сефадексом А-50 при pH 7,2 и высокой ионной силе. Отделение кининогена от других кислых белков осуществляли путем адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите, а затем гельфильтрации на сефадексе G-200 максимальная очистка достигнута применением в качестве последнего этапа препаративного электрофореза в полиакриламидном геле. [c.172]

Ионообменная хроматография. Этот вид хроматографии можно считать вариантом адсорбционной хроматографии. Принцип метода состоит в том, что ионо-обменник обратимо адсорбирует заряженные молекулы. Существует два типа ионообменников катиониты (несут отрицательные заряды, например 80 карбоксильные группы) и аниониты (заряд положительный, например, четвертичная аминогруппа, алифатические или ароматические аминогруппы). Матрицы бывают декстрановые, целлюлозные, акрильные, фенольные, используются смолы дауэкс и др. Мембранные белки (как и полисахариды) лучше разделяются на ионообменниках на основе целлюлозы, декст-рана и полиакриламида. [c.108]

Чтобы не путать с предыдущим разделом, этот раздел, в котором описано то, что обычно понимается под названием аф- финная хроматография , озаглавлен Аффинная адсорбционная хроматография . В этом случае биоспецифический отбор происходит на стадии адсорбции, так как выделяемый белок обладает специфическим сродством к адсорбенту благодаря его способности связывать лиганд (рис. 4.32). Нет четкого разделения между действительно специфическими аффинными адсорбентами, которые кроме белков, имеющих центры связывания для иммобилизованного лиганда, связывают мало других белков, и адсорбентами общего типа, которые хотя и проявляют специфичность к определенным классам белков, связывают также и многие другие. Описание адсорбентов второго типа можно начать сокращенных адсорбентов, обладающих значительной избирательностью к ферментам, имеющим нуклеотидсвязывающие центры, а затем перейти к таким адсорбентам, как фосфоцеллюлоза, которая, будучи в основном ионообменником, часто используется в качестве псевдоаффинного носителя для белков, связывающих нуклеиновые кислоты [70], и ферментов, взаимодействующих с фосфорилированными сахарами [62, 63]. Хотя [c.146]

В заключение следует отметить, что при аффинной адсорбционной хроматографии энергия взаимодействия между белком и носителем должна составлять по крайней мере 35 кДж-моль , что редко наблюдается при единичном взаимодействии белок — лиганд. Половина (и даже более) этой величины иногда приходится на неспецифические взаимодействия, обусловленные гидрофобными силами между аминокислотными остатками на поверхности белковой молекулы и удлиняющим мостиком. В этом случае аффинная элюция должна давать хорошие результаты и вполне достаточно весьма слабых специфических взаимодействий. Низкий процент связывания белка аффинным адсорбентом в некоторых случаях можно объяснить необходимостью биоспецифичного взаимодействия в двух точках (рис. 4.40), но более вероятно, что это обусловлено необходимостью еще и неспецифического связывания (помимо био-специфического). Если на взаимодействия обоих указанных типов налагаются строгие пространственные ограничения, то лишь относительно небольшое число молекул лиганда будет ориентировано надлежащим образом и сможет связаться белком (рис. 4.41). [c.156]

Динамическая модификация метода адсорбции — хроматография существует около 70 лет. Однако методы хроматографии низкомолекулярных веществ не могли быть непосредственно применены для хроматографии таких высокомолекулярных соединений, как белки, нуклеиновые кислоты и особенно вирусов. Этому предшествовала большая экспериментальная работа но выбору и синтезу сорбентов и разработке новых хроматографических методов. Из методов адсорбционной хроматографии наиболее удачным оказался метод хроматографии на фосфате кальция, предложенный Тизелиусом в 1954 г. [799]. Оя был использован для очистки вируса гринна, герпеса, иолиов уса, энцеф ало миокардита, арбо виру сов и многих других. Но наибольшего успеха достигли Петерсон и Собер [636], В 1956 г. они синтезировали ионообменники на основе целлюлозы. Принципиальным преимуществом целлюлозных сорбентов по сравнению с ионообменными смолами явилась возмож- [c.44]

К сорбентам для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии белков, ферментов и других биологических объектов предъявляются значительно более жесткие требования по инертности поверхности, чем к сорбентам для разделения синтетических полимеров. Кислые силанольные пруппы силикагеля обладают высокой адсорбционной активностью, проявляют слабые ионообменные свойства и способны денатурировать белковые молекулы. Поэтому поверхность жестких сорбентов очень тщательно модифицируют прививкой монослоев нейтральных гидрофильных органических групп. К таким сорбентам относятся ц-бондагель Е и материалы, содержащие глицерильные группы. Поверхность д-бондагеля Е модифицирована алифатически-ми эфирными группами. Колонки с этим сорбентом можно использовать с любыми растворителями от пентана до буферных растворов в области pH от 2 до 8. Они характеризуются высокой разрешающей способностью, но из-за малого рабочего объема (примерно 1,2 мл на колонку) требуется особо точная подача подвижной фазы. [c.108]

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству)-в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов. [c.27]

Поэтому до настоящего времени не нашли широкого распространения в области полисахаридов такие виды хроматографии, как распределительная и адсорбционная (отдельные примеры см." ). Более успешным оказалось применение ионообменной хроматографии для разделения кислых и даже нейтральных полисахаридов. Ионообменниками служат обы.ч,но аниониты, полученные модификацией целлюлозы, например ДЭАЭ-целлюлоза. Для элюирования полисахаридов с колонок используют растворы солей или буферные растворы разной концентрации прочно удерживаемые полисахариды элюируют разбавленными растворами щелочей. Таким споссбом легко удается отделить кислые полисахариды от нейтральных, например, пектиновую кислоту от сопутствующего ара-бинана или сульфированные полисахариды водорослей от крахмалоподобных примесей в ряде случаев при таком способе разделения удается освободиться от примесей белка. Нейтральные полисахариды можно разделить, применив ДЭ.ЛЭ-целлюлозу в боратной форме, при вымывании боратным буфером . Описано также успешное применение ЭКТЕОЛА- [c.486]