Белок хроматография

Изучение химического строения белка начинают с определения аминокислотного состава. Для этого проводят полный кислотный гидролиз белка с последующим разделением и идентификацией аминокислот гидролизата. С развитием методов хроматографии эта задача ре-щается достаточно просто. [c.376]

Хроматографический метод исследования используется для установления аминокислотного состава гидролизатов и первичной структуры белков в изучении аминокислотного состава плазмы и других биологических сред, при количественном определении витаминов, гормонов и иных биологически активных соединений. В силу высокой чувствительности и разрешающей способности метода хроматография применяется для выделения различных веществ в чистом виде и их идентификации. В настоящее время хроматографический анализ биологических жидкостей успешно служит целям диагностики разнообразных заболеваний. [c.174]

Обработку супернатанта (надосадочной жидкости) проводят с целью освобождения от нуклеиновых кислот (действие нуклеазами, высокомолекулярными катионами-полиэтилениминами и др.), от других белков (хроматография). [c.463]

В книге изложены современные химические методы, применяемые в исследованиях по биохимии белка. В сжатой форме автор дает описание различных методов и на конкретных примерах показывает возможности их успешного использования. Большое внимание уделяется описанию методов исследования состава и структуры индивидуальных белков хроматографии на бумаге, ионообменной хроматографии аминокислот и пептидов (на смолах), высоковольтного электрофореза на бумаге, определения последовательности аминокислот в белках и др. Описание отдельных методов сопровождается большим числом иллюстраций, изображающих используемую аппаратуру. [c.4]

Еще один мощный и универсальный способ очистки белков-хроматография по сродству (аффинная хроматография). В основе метода лежит характерное для многих белков высокое сродство к специфическим химическим группам. В частности, расти- [c.25]

Работа 66. Очистка белков методом гель-хроматографии [c.235]

Адсорбция и хроматография белков и вирусов [c.340]

Разделение белков хроматографией на целлюлозных ионитах. . . 220 Литература. .................................................232 [c.206]

В конце 40-х — начале 50-х годов нашего века химикам удалось обстоятельно проанализировать с помощью метода бумажной хроматографии смеси аминокислот, полученные при расщеплении ряда белков. В результате удалось установить общее число остатков каждой аминокислоты, содержащихся в молекуле белка, однако порядок расположения аминокислот в полипептидной цепи при этом определить, естестве шо, было нельзя. Английский химик Фредерик Сенгер (род. в 1918 г.) изучал инсулин — белковый гормон, состоящий примерно из пятидесяти аминокислот, распределенных между двумя взаимосвязанными пол и пептидными цепями. Сенгер расщепил молекулу на несколько более коротких цепей и проанализировал каждую из них методом бумажной хроматографии. Восемь лет продолжалась кропотливая работа по складыванию мозаики , но к 1953 г. был установлен точный порядок расположения аминокислот в молекуле инсулина. Позднее таким же способом было установлено детальное строение даже больших молекул белка [c.130]

Фракционирование методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) основано на применении принципа молекулярного сита, т. е. разделение молекул происходит только по размерам и не зависит от химической природы компонентов. Это свойство отличает метод ГПХ от всех других методов, основанных на растворимости полимеров. Возможность разделения только по размерам особенно важна для сополимеров и полимерных веществ биологического происхождения (белков, нуклеиновых кислот и др.). [c.96]

Разделение белков хроматографией на целлюлозных ионитах [c.220]

Гель-хроматографию используют для определения молекулярных масс (М) белков, полимеров, углеводородов и др. При этом используют линейную зависимость объемов выхода вещества от его молекулярной массы [c.240]

Изменение состава элюента осуш ествляют или ступенчато, или непрерывно (градиентная элюция). В табл. 3 приведены наиболее часто встречаюш иеся условия сорбции и элюция белков. Хроматографию, как правило, проводят в области pH 4,5—8,5, что отвечает зоне pH — стабильности большинства белков. [c.223]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Влияние на адсорбцию полимеров химии поверхности адсорбента и природы растворителя. Влияние на адсорбцию полимеров размеров пор адсорбента. Адсорбция из растворов и адсорбционная хроматография олигомеров. Адсорбционная и ситовая хроматография полимеров. Адсорбция и хроматография белков и вирусов. [c.332]

Хроматографический анализ органических веществ развивался попутно с хроматографией неорганических веществ. В 1935—1936 гг. появились первые сообщения об успешном применении метода Цвета в анализе синтетических красителей. Из жидкофазных вариантов хроматографии наиболее широкое применение в органической и биологической химии получила бумажная хроматография. Это тонкий микрометод, позволяющий разделять смеси нескольких десятков компонентов на полоске пористой бумаги, которая выполняет роль хроматографической колонки. Хроматограмма получается в виде пятен, которые имеют окраску, соответствующую природной окраске разделяемых компонентов смеси. При анализу бесцветных веществ пятна появляются на бумаге после опрыскивания ее подходящим реактивом. Например, при анализе аминокислотного состава белков после их гидролиза бумагу опрыски- [c.10]

В настоящее время хроматография — один из наиболее распространенных методов анализа и выделения витаминов, антибиотиков, белков, гормонов, аминокислот и других природных соединений. [c.71]

В 1944 г. Мартин и др. [7] предложили заменить инертный носитель фильтровальной бумагой, заложив тем самым экспериментальные основы распределительной хроматографии. Бумага удерживает в порах молекулы воды, сорбируя их из воздуха (неподвижный растворитель). При соприкосновении подвижного растворителя с бумагой, на которую нанесены хроматографируемые вещества, последние переходят в подвижную фазу и перемещаются с различными скоростями, вследствие чего и происходит их разделение. В настоящее время распределительная хроматография на бумаге нашла широкое применение для разделения различных веществ аминокислот, белков, углеводов, антибиотиков, неорганических веществ и др. [2, 3, 4, 7—10]. [c.74]

Подбором структуры нор и химии поверхности адсорбента, а также оптимальных условий элюирования можно осуществить концентрирование и очистку биополимеров методами адсорбционной и (или) ситовой хроматографии. В последнем случае крайне важно устранить сильную адсорбцию белков и вирусов на внешней поверхности макропористых зерен. [c.343]

Многократное повторение актов адсорбции и десорбции при течении раствора через слой адсорбента приводит к отставанию наиболее поверхностно-активных компонентов, что позволяет определить их содержание в исходном растворе или отделить их от других, менее адсорбционно-активных веществ. Методы адсорбционной хроматографии широко применяются для фракционирования аминокислот, нуклеиновых кислот, белков и других биополимеров, для выделения различных ферментов и лекарственных препаратов (пенициллина, тетрациклина, алкалоидов и др.). [c.93]

Раздел Энзимология рассчитан на студентов, уже иознакомиз-" шихся с некоторыми современными методами химии белка определением концентрации белка, хроматографией, электрофорезом и др. Основная цель его состоит в том, чтобы дать возможность студентам приобрести навыки экспериментальной работы, необходимые для начинающего энзимолога. В ходе практикума студенты осваивают методы выделения и очистки какого-либо фермента, а также изучают свойства полученного препарата. В связи с этим приводятся общие указания по работе с ферментами, способам их очистки, правилам определения каталитической активности и кинетических свойств. Во второй части раздела описываются методы выделения ферментов из пекарских дрожжей и животных тканей (скелетных мышц, печени). Поскольку современные методы очистки ферментов включают большое разнообразие приемов, в ряде случаев для получения одного и того же фермента дается описание 2—3 методик, которые могут быть использованы в соответствии с уровнем оснащенности лаборатории. Кроме того, для ферментов из разных источников приводятся различные методы выделения. [c.196]

ДЭАЭ-целлюлоза благодаря своей функциональной группе — диэтиламиноэтильному остатку — обладает свойствами слабого анионообменника. Ее используют главным образом для разделения природных высокомолекулярных полимеров, особенно чувствительных к резким изменениям pH и температуры, т. е. в первую очередь для фракционирования белков. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе отличается высокой разрешающей способностью. Этот ионообменник пригоден как для аналитического, так и- для препаративного фракционирования белков на колонках соответствующего размера. [c.204]

В последние годы в связи с развитием новейших методов фракционирования белков (хроматография на ионитах, препаративный электрофорез и т. п.) получены еще более активные препараты холинэстеразы сыворотки крови [83, 84]. Наибольшей активностью характеризуются препараты, полученные Янцем и Коэном [83] (уд. активность 10 /жг). По обычно принимаемым для белков критериям (кривые седиментации в ультрацентрифуге, электрофорез) эти препараты представляют собой индивидуальные белки с коэффициентом седиментации S o 9,9. [c.164]

Аминокислоты, в количестве обьрпю не менее ста, соединяются между собой пептидными связями, образуя полипептидную цепь, Пептцдная связь соединяет а-карбок-сильную группу одной аминокислоты с а-аминогруппой другой. В некоторых белках отдельные боковые цепи соединяются между собой дисульфидными мостиками, образующимися путем окисления остатков цистеина. Белки состоят из одной или нескольких полипептидных цепей. Каждый белок имеет уникальную последовательность аминокислот, которая детерминируется генетически. Определение последовательности аминокислот в белках проводят следующим образом. Сначала определяют общий аминокислотный состав, подвергая кислотный гидролизат белка хроматографии на ионообменнике, и проводят идентификацию N-кoнцeвoгo аминокислотного остатка с помощью реагента на концевую аминогруппу, например дансилхлорида. Следую- [c.43]

Хроматографический анализ органических веществ развивался попутно с хроматографией неорганических веществ. В 1935— 1936 гг. появились первые сообщения об успешном применении метода Цвета в анализе синтетических красителей. Из жидкофазных вариантов хроматографии наиболее широкое применение в органической и биологической химии получила бумажная хроматография. Это тонкий микрометод, позволяющий разделять смеси нескольких десятков компонентов на полоске пористой бумаги, которая выполняет роль хроматографической колонки. Хроматограмма получается в виде пятен, окраска которых соответствует природной окраске разделяемых компонентов смеси. При анализе бесцветных веществ пятна проявляют, опрыскивая бумагу реактивом, образующим с разделяемыми компонентами окрашенные соединения. Например, при определении аминокислотного состава белков после их гидролиза бумагу опрыскивают раствором нин-гидрина, в результате чего на поверхности бумаги появляются пятна розового цвета, соответствующие индивидуальным аминокислотам (см. рис. 1.2). Если разделяемые бесцветные вещества обладают способностью к флуоресценции, бумагу облучают ультрафиолетовыми лучами (кварцевой или ртутной лампой) и тогда хроматограмма становится видимой. Этот случай можно наблюдать при разделении смеси антрахинонов, пятна которых в ультра- [c.9]

В качестве другого примера применения таких полимеров может служить разделение оптических антиподов антибиотиков, энантиомерпый состав которых легко и быстро может быть установлен методом газовой хроматографии. Усилия Байера и сотр. приблизили химиков-органиков еще на один шаг к синтезу хиральных матриц с заранее заданными свойствами. Как и белки, они могут активно взаимодействовать с энаитиомерами самых разных соединений. [c.301]

Ферментативные системы, связанные с функцией кофермента В12, достаточно сложны. В связи с этим имеется несколько сообщений об очистке В12-зависимых ферментов или В12-связывающих белков с помощью аффинных сорбентов, обладающих сродством к витамину В12. Фактически для очистки ферментов или белков аффинная хроматография широко используется как один нз наиболее привлекательных методов [270]. С этой целью был разработан метод синтеза нерастворимого носителя кобаламинсефарозы (рис. 6.14). Этот носитель использован для очистки М-5-метилтетрагидрофолатгомоцистеин1юбаламинмстилтрапс-феразы из Е. oli. [c.394]

Тонкослойная хроматография. Тонкослойная хроматография — эффективный метод анализа сложных смесей веществ различных классов — углеводородов, спиртов, кислот, белков, углеводородов, стероидов II т. д. Она заключается в следующем. На одну сторону небольшой стеклянной пластинки с помощью специального валика наносят тонкий слой сорбента. На стартовую линию слоя сорбента наносят пробы веществ и их смесей край пластинкн ниже стартовой линии погружают в систему растворителей, налитую в широкий сосуд с пришлифованной крышкой. За счет капиллярных сил растворитель продвигается по пластинке. По мере продвижения жидкости по пластинке смесь веществ разделяется. Границу подъема жидкости, илп линию фронта, отмечают, пластинку сушат и проявляют. Отмечают, как указано па рнс. 77, положение пятен, соответствующих исследуемым веществам и находящихся между линией старта и линией фронта жидкости. Для этого измеряют расстояние от центра пятна до стартовой линии (отрезок а). Далее определяют расстояние от линии фронта жидкости до стартовой точки (отрезок Ь). Отношение отрезка а к отрезку Ь обозначают через константу / /, характеризующую положение вен1ества на данной хроматограмме. [c.70]

Специфичность методов аффинной хроматографии наряду с избирательной сорбцией кетоаминной фракции НЬ Ale на ПААГ определяется спектрофотометрической детекцией гема, имеющего максимальную величину оптической плотности при длине волны 415 нм. Это обстоятельство позволяет избежать искажения результатов анализа за счет присутствия других гликолизированных белков эритроцитов или плазмы крови. [c.67]

Примером может служить применение гель-хроматографии для диагностики заболеваний щитовидной железы. В этом случае используется избирательное сродство трииодтирозина к сефадексу. Предварительно сыворотку инкубируют в стандартных условиях с гормоном, меченным радиоактивным иодом, затем хроматографируют на колонке с сефадексом. Растворителем служит вода. В результате получают три ника пик связанного с белком гормона, пик свободного гормона и между ними пик радиоактивного иода, образовавшегося при фотохимическом разложении гормона. Диагноз устанавливают по количеству иода, т, е. по величине пика. [c.233]

За последние годы в связи с возросшей необходимостью анализа и разделения смесей сложных веществ получила значительное развтие ситовая хроматография (гель-проникающая, гель-фильтра-ционная, молекулярно-ситовая). В качестве подвижной фазы в этом случае используются только жидкости, а неподвижной фазой являются материалы с заданной пористостью, способные избирательно удерживать молекулы веществ с определенными размером и формой. Так, например, в качестве фильтрующих материалов используются сшитые гидрофильные полимеры (гели), обладающие строго регулярной пространственной структурой. При пропускании через гель водных растворов белков или других водорастворимых биологических материалов удается удерживать внутри решетки геля молекулы определенного размера, а более крупные молекулы беспрепятственно вымываются подвижной фазой. При этом компоненты смеси элюируются в порядке уменьшения молекулярной массы. [c.49]

Методы анализа фракций могут быть физическими, химическими и биологическими. Одним из лучших методов считается детектирование радиоактивных изотопов. Результаты измерений оформляют в виде кривой зависимости определяемой величины от объема злюата. По распределению пиков на хроматограмме судят о возможности объединения некоторых фракций, совершенно чистых, без примесей других компонентов. Методом ионообменной хроматографии можно разделять различные катионы и анионы, четвертичные аммониевые основания, амины, аминокислоты, белки, продукты гидролиза пептидов, физиологические жидкости, гидролизаты клеточных оболочек микробов, антибиотики, витамины, нуклеиновые кислоты. [c.361]

Биоспецифическая хроматография применяется для очистки ферментов, так как она позволяв извлекать ферменты из сложных смесей в одну стадию с высокой степенью очистки и с большим выходом. В последнее время в качестве адсорбентов-носителей в биоспецифической хроматографии находят применение как макропористые неорганические адсорбенты (силикагели, силохромы, пористые стекла), так и макропористые органические сшитые сополимеры, например макропористые сополимеры глицидилме-такрилата с этилендиметакрилатом типа сферой (см. лекцию 6) со сферическими зернами разных размеров. Эти адсорбенты-носители обладают разной удельной поверхностью и крупными порами разных размеров. На рис. 18.10 представлен пример биоспецифической хроматографии химотрипсина на сфероне с иммобилизованным химической прививкой белком — ингибитором трипсина (являющегося также ингибитором химотрипсина). Из колонны, заполненной обычным макропористым сфероном без иммобилизованного ингибитора, химотрипсин выходит вместе с остальными белками, а из колонны, заполненной сфероном с привитым ингибитором, сопутствующие белки выходят приблизительно за то же время, а химотрипсин прочно удерживается. Это позволяет отделить [c.342]

По своим задачам хроматография разделяется на аналитическую и препаративную. Аналитическая хроматография преследует цель констатировать наличие нескольких компонентов в анализируемой смеси, идентифицировать эти компоненты (или убедиться, что какие-то из них не соответствуют никакому из ранее исследованных химических соединений) и количественно определить содержание каждого из них. При аналитической хроматографии можно для обнаружения веществ на выходе из колонки, в тонком слое или на бумаге превратить их в какие-либо другие, легче обнаруживаемые вещества. Например, при анализе аминокислотного состава белков на выходе из колонки к бесцветному раствору, вытекающему из колонки, добавляют специальное вещество — нингидрин, которое превращет аминокислоты в синий краситель. В результате этого зоны, содержащие разделенные аминокислоты, выходят в виде окрашенного раствора, измерение оптической плотности которого позволяет определить содержание красителя, а значит, и исходное содержание аминокислоты в каждой зоне. [c.343]

Важнейшей областью применения электрофореза является анализ биоколлоидов, например анализ смесей белков в клиническом анализе. Белки, как амфотерные полиэлектролиты, обладают собственными зарядами, зависящим от pH среды. Регулируя значение pH, можно в широких пределах менять их подвижность и даже изменить направление движения в процессе электрофореза. Для каждого белка при определенном значении pH общее число положительных зарядов равно общему числу отрицательных зарядов. Эта иэоэлектрическая точка, при которой отсутствует движение частиц, является характерной величиной для определенного белка. Растворимость белка в этой точке минимальна. Подбирая соответствующие буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно приспособить процессы электрофореза для решения разных проблем разделения веществ. Таким образом, электрофорез превосходит метод бумажной хроматографии. Кроме того, при помощи электрофореза, особенно при высоком напряжении, можно проводить разделение неионогенных веществ (например, сахар в виде боратного комплекса) [791. Методом электрофореза можно также определять изоэлектрические точки амфотерных веществ или заряды коллоидных частиц (по направлению движения). [c.387]

Последние годы ознаменовались огромными успехами в изучении строения и функций важнейших биологически активных полимеров. Благодаря развитию новых методов разделения н очистки веществ (различные методы хроматографии, электрофореза, фракционирования с использованием молекулярных сит) и дальнейшему развитию методов рентгеноструктурного анализа и других физико-химических методов исследования органических соединений стало возможным определение строения сложнейших природных высокомолекулярных соединений. Изучено строение ряда белков (работы Фишера, Сейджера, Стейна и Мура). Установлен принцип строения нуклеиновых кислот (работы Левина, Тодда, Чаргаффа, Дотти, Уотсона, Крика, Белозерского) и экспериментально доказана их определяющая роль в синтезе белка и передаче наследственных признаков организма. Определена последовательность нуклеотидов для нескольких рибонуклеиновых кислот. Широкое развитие получили работы по изучению строения смешанных биополимеров, содержащих одновременно полисахаридную и белковую или липидную части и выполняющих очень ответственные функции в организме. [c.53]

Гель-хроматография применяется, как уже указывалось, при обессиливании растворов (малые по размеру ионы солей проникаю в поры ге я и удерживаются там), для группового разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных органических соединений (например, глицериде в жирных кислот с молекулярной массой около 200—500), в анализе биологических объектов (часто с использованием буферных систем с целью предотвратить разрушение ферментоп), для определения молекулярной массы белков (в том числе содержащихся в сыворотке К]ювп, в спинн( -мозговой жидкости), углеводородов и др)гих вещеста. [c.285]