Ферменты очистка и изолирование

Вплоть до 10-20-х годов XX столетия основным направлением исследований явления биокатализа было изучение самого каталитического акта, фиксирование и анализ изменений, происходящих в присутствии биокатализаторов-фермен-тов. Начиная с этого времени, основные успехи в изучении явлений биокатализа связывают с изучением изолированных ферментов, а на первых порах - даже с развитием методов выделения и очистки ферментов. Этот путь дал много нового в познании свойств ферментов. [c.133]

Одной из наиболее актуальных и увлекательных проблем современной биохимии является выяснение молекулярных механизмов регуляции ферментативной активности. Необходимым этапом на пути к пониманию закономерностей, лежащих в основе жизнедеятельности клетки, является изучение структуры, свойств и способов регуляции каталитической активности изолированных ферментов. Однако при этом следует иметь в виду, что высокая степень очистки в отдельных случаях может привести к изменению или исчезновению регуляторных свойств фермента [1]. [c.136]

Мол. масса РНК-полимеразы I, независимо от источника, составляет 500-600 кДа. Все ферменты содержат от 9 до 14 различных полипептидных субъединиц в зависимости от происхождения, а также методов и аналитических процедур, использованных при их очистке. Обычно ферменты содержат две большие полипептидные субъединицы мол. массой более 100 к Да каждая. Большие субъединицы РНК-полимеразы I имеют участки, гомологичные участкам соответствующих двух больших субъединиц РНК-полимераз II и III и дают перекрестную реакцию с некоторыми антителами к этим полимеразам. Интересно, что у больших субъединиц РНК-полимеразы I и двух больших субъединиц РНК-полимеразы Е. соИ также встречаются гомологичные участки. Размер других субъединиц варьирует от 15 до 50 к Да. Три полипептида меньшего размера есть у всех трех РНК-полимераз, два других-только у РНК-полимераз I и III, а остальные у разных ферментов разные. Функции ни одной из этих субъединиц пока не установлены. Вероятно, изолированная РНК-полимераза I представляет со- [c.27]

Во многих случаях катализатор используется в изолированной форме в виде очищенного фермента, для получения которого в настоящее время разработаны эффективные методы выделения и очистки, а также методы стабилизации. [c.14]

В наших лабораториях мало применялся ферментативный гидролиз протеинов. Причина этого лежит в неуменьи разделять ферменты, идентифицировать, очищать от примесей. Действие смеси ферментов, добываемых нами из желудочного сока животных, из секретов желез, из клеток организмов, не позволяет вести процесс распада строго по стадиям от протеина до аминокислоты аналогично ходу его в организмах, отклоняет реакцию в сторону получения вторичных образований и даже не исключает одновременно и синтеза (Данилевский). Только в самое последнее время Вильштетером, а за ним другими исследователями открыты способы очистки и изолирования ферментов один от другого. Эти успехи в области исследования ферментов, даже при нынешнем начальном, далеком от совершенства состоянии, дали в руки исследователей новое средство к изучению белковых веществ. Реакции с протеинами приближены к естественным, имеющим место в организмах условиям, а это во многом поможет разобраться в трудно разрешаемой белковой проблеме. [c.18]

Химический анализ природного соединения, как известно, включает в себя ряд общих процедур, таких, как экстракция, выделение, очистка и определение его химической структуры. Для извлечения неизвестных соединений обычно используют путь ступенчатой экстракции растворителями по мере возрастания их полярности петролейный эфир, бензол, серный эфир, этилацетат, спирты и вода. Преимуществом спиртовых экстракций перед водными является низкая точка кипения этих растворителей, однако в этом случае возможно расщепление эфирных связей, например эфиров фенолов с сахарами (Swain, 1965). Недостатки водной экстракции извлечение большого количества посторонних веществ, невозможность предотвращения действия всех ферментов, функцию которых не может устранить даже кипячение. Дифференцированный подход следует избирать и при выборе метода разделения веществ. Разделение на бумаге Ватман 3 ММ удобно применять в том случае, когда нужно получить до 0,5 г вещества, разделение на колонках — для выделения больших количеств вещества. Ниже приводится схема препаративного выделения, использовавшаяся для изолирования и идентификации природного ингибитора роста капусты (фенольное вещество, 12 мг из 500 г листьев), ивы (халконглюкозид, 75 мг из 1000 г листьев), гороха (кверцетин-гликозил-кумарат, 500 мг, п-кумаровая кислота, 10 мг) и кукурузы (л-кумаровая кислота, 4 мг из 250 г листьев). Из листьев гороха была выделена также кофейная кислота. [c.34]

Вероятно, все ФОС могут разрушаться в организме животных, и в некоторых случаях это разрушение протекает с большой скоростью. Исследование процессов разрушения ФОС in vitro проводилось более интенсивно, чем in vivo, прежде всего потому, что в этих условиях могут быть использованы высокие концентрации ФОС, которые вызывали бы быструю гибель интактных животных. В этих опытах отпадает необходимость в применении меченых соединений. Кроме того, в опытах in vitro изолированные ферментные системы можно подвергать очистке и таким путем преодолевать экспериментальные трудности, возникающие в тех случаях, когда молекула ФОС подвергается действию нескольких ферментов одновременно. [c.139]

Обычно выделение и очистка нового биорегулятора являются сложной задачей, при решении которой используются самые разнообразные методы и их комбинации. В качестве характерного примера современной методики довольно сложной очистки ниже приведен способ изолирования фермента аргиназы, способного расщеплять аминокислоту аргинин (Сору, 1965). Ее получают из культуры бактерий Staphylo- [c.28]

Исходным сырьем для промышленного получения гепарина является печень и легкие. Изолирование его представляет сложную, многостадийную процедуру (описанную в ряде патентов), включающую автолиз с водой и ксилолом при комнатной температуре, извлечение щелочью и сульфатом аммония (при 50—55°), удаление главной части белков после свертывания (при 70—80°) и осаждение комплекса гепарина с белком при pH 2,5. Далее удаляют примеси жиров спиртом, примеси белков — трипсином после удаления фермента гепарин осаждают ацетоном. Дальнейшая очистка достигается обработкой реактивом Ллойда, фракционированием ацетоном, обработкой хлористы1 [ кадмием и оксалатом аммония, осаждением бензидином и, наконец, получением и кристаллизацией бариевой соли [190]. В лабораторных условиях для очистки гепарина применяется фракционирование с использованием хлористого цетилпиридиния и колоночная хроматография на ионообменных смолах. [c.228]

Длй количественной оценки эффективности С1ЮС0ба выделения субклеточных структур можно использовать метод, предложенный А. И. Арчаковым и соавторами (1973). Суть его заключается в следующем. Определив общую активность индикаторных ферментов мёмбран цитоплазматической сети в исходном гомогенате и полученном препарате (активность ферментов рассчитывают на общее количество белка гомогената или фракции), можно легко рассчитать выход микросомной фракции в процентах от содержания ее в гомогенате. Измеряя удельную активность индикаторных ферментов цитоплазматической сети (выделяемая структура) и загрязняющих препарат структур (митохондрий, лизосом, пероксисом) в гомогенате и изолированном препарате микросом, можно рассчитать степень очистки фракции по формуле [c.52]

Для того чтобы исследовать метаболизм углерода, транспорт метаболитов в хлоропластах и компартментацию ферментов в клетке (чему посвящена большая часть этой книги), необходимо прежде всего получить изолированные хлоропласты, которые при этом должны быть интактными, в достаточной степени очищенными от других субклеточных структур и биохимически активными. В некоторых случаях требуется очеиь высокая степень очистки хлоропластов (иапример, для установления локализации тех ферментов, которые присутствуют только в очень небольших количествах), поэтому может оказаться, что гораздо вал<иее освободиться от каких бы то ни было примесей н загрязнений, чем получить хлоропласты, способные осуществлять фотосинтез с очень высокой скоростью. При других обстоятельствах можно поступиться степенью очистки ради сохранения максимального уровня активности, ио наличие примеси цитоплазматических ферментов в препарате может очень усложнить интерпретацию полученных результатов (гл. 8). К тому же важно ие забывать два обстоятельства, которые часто упускают из виду, несмотря на то что это само собой разумеется. Во-первых, абсолютно невозможно получить хорошие хлоропласты из плохого исходного материала (см. разд. А.З). Во-вторых, хорошие хлоропласты будут работать хорошо только тогда, когда с ними будут правильно обращаться. Если оглянуться назад, то станет совершенно ясно, что после того, как в начале 60-х годов в практику были снова введены приемы Хилла, использовавшего в качестве осмотически активного вещества сахара, в плане улучшения методики выделения хлоропластов было сделано очеиь мало, если, конечно, ие считать предварительного получения протопластов (см. разд. А.5). Все последующие улучшения методики, способствующие получению более активных хлоропластов, касались главным образом методики определения активности, и в частности были связаны с введением в среду неорганического пирофосфата (разд. 8.14). [c.543]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология