Ферменты активные на поверхности раздела

Адсорбция фермента очень сильно зависит От состава и реакций среды. Поэтому, промывая адсорбент после адсорбции небольшими порциями того или иного растворителя или даже водным раствором с измененным pH, можно вытеснить адсорбированный фермент с поверхности адсорбента. Это вытеснение адсорбированного вещества получило название элюции. Для дальнейшей очистки эту операцию с адсорбцией и элюцией повторяют несколько раз и таким образом получают фермент очень высокой чистоты и весьма большой активности. Методика Вильштеттера не только позволяет очищать ферменты, но и разделять смеси ферментов, отделяя их один от другого. [c.258]

Недавно было показано [33], что в органических растворителях можно солюбилизировать также и относительно высокие концентрации биополимеров-ферментов. Важно то, что фермент практически полностью сохраняет при этом каталитическую активность и специфичность. По идимому, молекула фермента, будучи включенной в обратную мицеллу (рис. 13.8), защищена против денатурации (разворачивания ее структуры) тем, что поверхность раздела "фаз" между белковой глобулой (или соответственно ее поверхностным слоем воды) и органическим растворителем стабилизирована молекулами ПАВ. В итоге биокатализатор непосредственно может и не контактировать с неблагоприятной для него органической средой, находясь в своеобразном микрореакторе, содержащем всего лишь несколько сотен или даже десятков молекул Н2О на молекулу фермента. [c.244]

Ингибирование гидролитических ферментов может быть вызвано непосредственным воздействием ПАВ путем блокирования функциональных групп фермента или нарушения его третичной структуры либо вследствие блокирования субстрата в результате сорбции на нем ПАВ, что определяет его недопустимость для действия фермента. К тому же присутствие ПАВ вызывает нарушение энергетических соотношений на поверхности раздела между бактериальной клеткой и средой, что приводит при определенных концентрациях к подавлению активных обменных процессов бактерий, и в первую очередь метановых. Последнее подтверждается накоплением в иловой жидкости летучих жирных кислот и снижением фактического выхода газа по сравнению с расчетным, определяемым по распаду жиров, белков и углеводов. [c.42]

Во-вторых, все больше появляется доказательств того, что активные центры ферментов, в том числе и металлоферментов, находятся в полостях или карманах белковой структуры, которые выстланы главным образом неполярными боковыми цепями аминокислот и моделируют, таким образом, неводные растворы. Следовательно, связывание металла таким активным центром или вблизи него по сути осуществляется в неводных растворах, диэлектрические проницаемости которых должны отличаться от диэлектрических проницаемостей водных растворов электролитов, в которых было исследовано большинство комплексов металлов с пептидами. В то время как взаимодействие металлов с пептидами в водных растворах может адекватно представлять условия на поверхности раздела между белком и окружающей средой, оно не может быть хорошей моделью того, что происходит внутри белковой молекулы. [c.153]

Другим возможным способом классификации является систематизация по типам полимерных носителей реакционноспособных групп. Особую важность при этом приобретает вопрос активации полимеров. В предыдущем разделе были подробно рассмотрены методы введения различных реакционноспособных групп в полимерные структуры. Приведенные примеры можно обобщить в виде схем для наиболее распространенных полимеров. На рис. 2.3 приводятся данные по полимерным реакциям таких распространенных и стабильных материалов, как полиэтилен и полипропилен. Эти полимеры практически не участвуют ни в каких ионных реакциях, число вводимых в них активных групп обычно незначительно. Как правило, модифицированные структуры очень устойчивы и имеют гидрофобный характер. Однако даже такой чрезвычайно стабильный промышленный пластик, как полипропилен, может быть использован в качестве полимера-носителя в очень тонких реакциях (например, в фиксации ферментов). Модификацию полиэтилена и полипропилена можно осуществлять непосредственно в процессе переработки, поскольку многие технологические процессы (формование волокон, пленкообразование) проводятся из расплава, что создает богатые возможности для введения других активных мономеров, получения привитых и блок-сополимеров и т. д. Сшитый сополимер стирола и дивинилбензола может подвергаться различным химическим превращениям (рис. 2.4). Эти материалы будут подробнее рассмотрены в разд. В.З, посвященном полимерным реагентам. Введение групп типа ЗОзН придает полистиролу гидрофильность и позволяет получить растворимый полимер, однако, если такие группы вводятся в сшитый полимер, реакция протекает в очень неоднородных условиях и число присоединенных групп сильно зависит от размера частиц, их пористости, состояния поверхности и т. д. Очевидно, что в процессах ионообмена выгодно иметь возможно большее число таких групп. Для получения большей ионообменной емкости необходимо вводить группы —80 зН и —Ы КзХ почти в каждое фенильное ядро. При использовании полистирола в качестве носителя (при твердофазном синтезе пептидов, ферментативном катализе, катализе переходными металлами и т. д.) требуется, чтобы количество введенных групп превышало 10%. Химическая модификация полистирола (рис. 2.4) может быть осуществлена [c.44]

Липолитические ферменты гидролизуют водонерастворимые субстраты, следовательно, они должны функционировать на границе раздела фаз. Обычно их молекулы состоят из трех участков гидрофобного, который создает необходимую ориентацию фермента на поверхности субстрата, и активного центра, находя- [c.158]

Простейший ферментный электрод включает находящийся в непосредственной близости к активной поверхности преобразователя тонкий слой фермента (или ферментов), подходящий электрод сравнения и цепь для измерения либо разности потенциалов между двумя электродами (потенциометрия), либо протекающего между ними тока (амперометрия). Обычно электрод покрывают мембраной, которая служит для защиты его от загрязнения и/или благодаря которой происходит распределение частиц на границе раздела фаз. При измерениях ферментный электрод просто погружают в раствор, содержащий определяемое вещество, и считывают стационарный ток или потенциал. Для амперометрического электрода амплитуда сигнала и концентрация связаны линейной зависимостью для потенциометрического электрода-логарифмической. [c.211]

Факторы, регулирующие активность ферментов, разнообразны по своей природе (рис. 28). Физические факторы (температура, давление, свет, магнитное поле, электрические импульсы) оказывают менее специфическое действие, чем химические. В свою очередь действие последних также может быть разделено на несколько типов. Одни химические вещества связываются с активным центром фермента, например субстраты, кофакторы, конкурентные ингибиторы, что приводит к изменению ферментативной активности. Другие вещества взаимодействуют со специальными участками на поверхности молекулы определенного типа фермента, не имеющими непосредственного отношения к центрам каталитической активности, но тем не менее приводящими к ее изменению. [c.113]

Поверхности, для которых выполняется это соотношение, имеют минимальную площадь. С молекулярной точки зрения стремление поверхности к сокращению основано на том, что силы притяжения между молекулами, находящимися внутри фазы, и молекулами, расположенными на поверхности, превышают силы притяжения между молекулами, находящимися внутри фазы. Когда речь идет о поверхности жидкости, граница раздела между жидкостью и воздухом выражена достаточно резко и состоит из слоя толщиной в одну-две молекулы. Поверхность молекулы глобулярного белка гораздо сложнее, она очень неровная и содержит разного рода выступы и выемки независимо от того, насколько компактно молекула свернута в трехмерную глобулу. Поверхность белка не может быть гомогенной, и особенно сложной она бывает в случае ферментов, для которых характерно наличие одного или двух активных центров. Мы ограничимся описанием поведения модельных молекул с однородной поверхностью в надежде на то, что поведение молекул глобулярных белков во многом ему подобно. Обычно в качестве модели выбирают сферу. Если речь идет о вытянутых спиральных структурах, то моделью могут служить длинные тонкие стержни, но, как правило, удобнее использовать в качестве модели вытянутый эллипсоид. Сферу или эллипсоид гораздо легче описать с помощью математических уравнений, чем другие возможные модели. [c.381]

Функцию металла в карбоксипептидазе можно рассматривать в двух аспектах участие в связывании субстрата и участие в катализе. Данные свидетельствуют в пользу того, что в активной ме-талло-КПА ионы металла участвуют как в связывании субстрата, так и в катализе, однако логически удобно разделить влияние металла на ориентацию субстрата на поверхности молекулы фермента и его участие в понижении энергии переходного комплекса. [c.542]

Со структурно-химической точки зрения различают три типа ингибиторов — конкурентные ингибиторы, присоединяющиеся к активному центру, аллостерические ингибиторы, присоединяющиеся к некоторым точкам поверхности белка вне активного центра, и аллостерические эффекторы широкого профиля — деформирующие структуру глобулы фермента в целом, воздействуя на большую часть ее поверхности. К последнему случаю, например, относится изменение активности фермента (как дезактивация, так и активация) при адсорбции на биомембране или при контакте с другими белками. Кроме того, даже конкурентные ингибиторы по структурному признаку можно разделить на два типа — взаимодействующие с адсорбционным центром и взаимодействующие главным образом с каталитическими группами. [c.70]

Гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие вносит важный вклад в специфичность химотрипсинового катализа (см. 2, 4, 5 этой главы). Это связано с тем, что составной нукЛеофил, входящий в активный центр фермента и принимающий участие в атаке сорбированной молекулы субстрата, расположен в поверхностном слое белковой глобулы [17—19, 66, 67]. Реакции, катализируемые химотрипсином, протекают таким образом вблизи поверхности раздела фаз вода — белок и сопровождаются термодинамически выгодным переносом (полным или частичным) гидрофобных фрагментов молекулы субстрата из одной среды (вода) в другую (белок). Свсбодная энергия такого рода гидрофобного взаимодействия, сопровождающего химическую реакцию между ферментом и субстратом, зависит от структуры субстрата, а также от геометрической конгруэнтности ее по отношению к активному центру (см. 5 этой главы). [c.150]

Другим следствием коллоидального состояния ферментов является образование поверхностей раздела между водной фазой и нерастворимой (коллоидальной) белковой фазой. Гетерогенный характер среды, в которой находятся ферменты, во многих случаях способствуют проявлению их действия. Так, например, гемин, который обладает сильно выраженным липооксидазным действием в гетерогенной среде (эмульсия вода — масло), совершенно теряет активность в указанном отношении при переводе эмульсии в гомогенный раствор путем добавления этилового спирта или желчных солей [14]. [c.275]

Различ1ное влияние сульфонола НП-3 и хлорного сульфонола на аэробные и анаэробные биохимические процессы, по-видимо-му, объясняется различной поверхностной активностью и, в частности, различной сорбционной способностью, изменяющей распределение ПАВ между твердой и жидкими фазами сброженного осадка. Опытами Луценко было показано, что примерно 96—97% сульфонола НП-3 сосредоточивается на твердой фазе, в то время как 16—24% хлорного сульфонола переходит в жидкую фазу. Таким образом, сульфонол НП-3 интенсивнее изменяет характер поверхности раздела фаз и, следовательно, оказывает более сильное влияние на действие гидролитических ферментов, доказательством чего является торможение распада жиров, белков и углеводов, снижение газообразования, изменение состава газа и иловой жидкости. [c.42]

Подобная зависимость свидетельствует о том, что дезактивация изученных ферментов в однокомпонентных адсорбционных слоях связана с построением на поверхности неактивных четвертичных структур, тогда как изолированные ферментные глобулы как на липидных, так и на нелипидных поверхностях оказались достаточно активными. В качественной форме этот вывод не зависит от применимости или неприменимости изложенной теории. Теория необходима только для проведения экстраполяции к 6 = О, т. е. для количественной оценки степени воздействия поверхности адсорбента на третичную структуру ферментных глобул и для описания состава слоя при всех 6, что необходимо для суждения о четвертичной структуре белкового слоя. Поэтому изучение зависимости А ) от степени заполнения позволяет разделить эффекты, связанные с ролью в катализе третичной и четвертичной структуры белка. Неучет этого обстоятельства приводит иногда к неправильным выводам о неактивности адсорбированных ферментов или о разворачивании ферментной глобулы на поверхности раздела фаз. В большинстве адсорбционных систем неактивность фермента связана только с его высокой концентрацией в поверхностном слое, т. е. дезактивация связана с межбелковыми контактами в белковом слое, а не с влиянием поверхности носителей, природа которых в цитированных работах [4—15] изменялась в довольно широких пределах — от полярных и неполярных неорганических поверхностей (ЗЮз и С) до фосфолипидных слоев, аналогичных фосфолипидным мицеллам биомембран. [c.294]

Многие ферменты, например участвующие в биосинтезе белка, функционируют, будучи вмонтированными в сравнительно жесткие структурные компоненты клетки, обладающие поверхностью раздела (рибосомы, мито-.шндрии). Таким образом, ферменты характеризуются признаками и гомогенных и гетерогенных катализаторов. По сравнению с небиологическими катализаторами ферменты более активны. Например, для разложения перекиси водорода на воду и кислород без катализатора энергия активации равна 18 тыс. кал. на 1 моль, при использовании в качестве катализатора коллоидной платины— 11,7 тыс., а при действии фермента каталазы — до 5500 тыс. кал. на 1 моль. У ферментов в реакции участвует одновременно несколько группировок активного центра. [c.9]

Основные недостатки этого способа иммобилизации — низкая скорость процесса вследствие небольшой площади поверхности раздела фаз, через которую осуществляется перенос субстрата и продукта, и возможность инактивации фермента при его адсорбции на границе раздела фаз. Именно последнее обстоятельство не позволяет применять интенсивное перемешивание системы для увеличения скорости процесса за счет возрастания пoвepxнo fи раздела, поскольку в образующейся эмульсии фермент быстро теряет активность. Чтобы преодолеть это затруднение и добиться увеличения поверхности раздела, в качестве ферментсодержащей фазы часто применяется крупнопористый неорганический носитель (например, пористое стекло), частицы которого пропитаны водным раствором фермента (рис. 10, б). [c.73]

Области применения аффинной хроматографии расширяются, поокольку метод основан на специфических взаимодействиях биологически активных веществ. Как видно из табл. 11.1, этот метод успешно используется при выделении самых разных соединений. Наряду с этим он полезен при изучении различных систем на аффинных сорбентах можно разделять низкомолекулярные энан-тиомеры и удалять нежелательные вещества из живых организмов. -Например, аффинной хроматографией можно разделить на оптические антиподы 0,Ь-триптофан. Используя специфическое выделение меченых пептидов, можно определить пептиды активного центра фермента, связывающего участка антител или участка пептидных цепей на поверхности молекулы. Аффинная хроматография может быть использована для изучения возможности замены природных пептидных цепей ферментов различными модифицированными синтетическими пептидами. Активные центры ферментов или антител, связывающие свойства субъединиц, специфичность ферментов по отношению к различным ингибиторам, комплементарность нуклеиновых кислот, взаимодействие нуклеотидов с пептидами, влияние присутствия различных соединений на образование специфических комплексов и т. д. могут быть исследованы с помощью аффинной хроматографии. [c.282]

Ферменты проявляют обычно свое каталитическое действие в водных растворах и, следовательно, по этому признаку могут быть отнесены к гомогенным катализаторам. Однако при более тщательном рассмотрении вопроса такое заключение оказывается не вполне точным. Дело в том, что ферменты — это белки с весьма большим молекулярным весом — от десятков до сотен тысяч и, следовательно, при обсуждении свойств многих из них мы вправе говорить о существовании в растворе ферментов поверхности (микроповерхности) раздела, характерной для гетерогенных катализаторов. Более того, каталитическая активность ферментов, как и гетерогенных катализаторов, определяется наличием на их поверхности особых участков ограниченного размера — активных центров, обладающих специфической реакционноспособностью. Многие ферменты, например ферменты переноса электронов в окислительновосстановительных реакциях, ферменты, участвующие в биосинтезе белка, и некоторые другие ферменты функционируют, будучи вмонтированными в сравнительно жесткие структурные компоненты клетки, обладающие макроповерхностью раздела (митохондрии, рибосомы и т. п.). [c.26]

На рис. 33 представлены результаты исследования ферментативной активности мембранной АХЭ в присутствии конканавалина А из канавалии мечевидной (Сопсапауа11а ensiformis) в концентрациях 0,4 и 0,8 моль/л. Конканавалин А относится к классу лектинов, связывание которых с поверхностью плазматической мембраны клеток имеет самые разнообразные последствия, например, вызывает изменение в расположении поверхностных белков и гликопротеинов, физическом состоянии липидов мембран, проницаемости их для различных веществ и активности мембранных ферментов (см. раздел 1.3). Конканавалин А, избирательно модифицируя структурно-функциональное состояние интегральных мембранных белков, способен изменять и фоточувствительность АХЭ. [c.151]

Тканевые материалы не только удлиняют срок службы биосенсора, но и обеспечивают большую концентрацию заданного биокатализатора. Примером может служить рассматриваемый в этом разделе биосенсор АМР с газоаммиачным датчиком. Ограниченная площадь поверхности датчика не позволяет иммобилизовать большие количества ферментного препарата. Поэтому если специфическая активность последнего невысока, то и аналитические характеристики сенсора будут неудовлетворительными. Эффект низкой концентрации фермента проявился, в частности, в случае ферментного АМР-электрода, описанного в работе [35]. Используемый в этом сенсоре выделенный фермент обычно имеет низкую активность, что приводит к малой величине наклона градуировочных кривых и короткому сроку службы. Чувствительность и срок службы сенсора АМР можно значительно улучшить при помощи тонкого слоя мышечной ткани кролика. Повышение чувствительности биосенсора непосредственно связано с пятикратным увеличением активности биокатализатора на поверхности датчика. [c.43]