Ацетилхолинэстераза, изучение активного центра

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Исследование кинетики ингибирующего действия четвертичных солей алкиламмония позволило установить различия в свойствах холинэстеразы и ацетилхолинэстеразы. Первоначально на основании, по-видимому, ошибочных экспериментальных данных Адамс и Уиттекер [133] сделали заключение, что активный центр холинэстеразы сыворотки вовсе не содержит анионной группировки, в то время как в ацетилхолинэстеразе она имеется. Однако Бергман и Вурцель [127] в результате подробного изучения влияния ионов тетраэтиламмония и других ингибиторов на активность холинэстеразы плазмы показали, что последняя содержит анионную группировку. Блокирование этой группировки приводит к снижению каталитического эффекта. Интересно, что четвертичные соли алкиламмония тормозили ферментативный гидролиз не только катионных субстратов типа ацетилхолина, но также и субстратов, не содержащих катионного центра, например, алкилгалогенацетатов или ди-ацетина. Очевидно, такой эффект солей тетраалкиламмония связан с их влиянием на конфигурацию активной поверхности белковой молекулы. [c.193]

Изучение. инактивации дало сведения об активной области некоторых гидролитических ферментов, в частности химот1рипсина и ацетилхолинэстеразы. а-Амино-кислоты или некоторые функциональные производные этих соединений, которые являются специфическими субстратами или конкурирующими ингибиторами для а-химотрипсина, могут быть описаны общей формулой R HR R", где R, R и R" — группы, определяющие свойства этих молекул соответственно а-амино- и.чи ацил-аминогруппа, боковая цепь а-аминокислоты и карбоксильная группа или производное карбоновой кислоты. Было высказано предположение [346], что вышеупомянутые специфические субстраты и конкурируюшие инги- биторы могут соединяться с ферментом путем взаимодействия групп R, R, R" и определенного ряда центров рь р2 и рз, которые, как предполагается, составляют каталитически активную область фермента. Полагают, что степень, с которой любое данное вещество будет связываться с активной областью фермента, зависит от того, в какой мере молекула и асимметрическая каталитическая поверхность дополняют друг друга, и также от того, насколько присоединяющаяся молекула и активная область способны изменять свои поверхности для улучшения контакта. Результаты кинетических исследований с применением ряда субстратов и конкурирующих ингибиторов а-химотрипсина согласуются [c.135]

Что Касается ацетилхолинэстеразы, то изучение обратимых ингибиторов, таких, как диамины и стерео-специфичные аминоспирты, проводилось с целью выяснения свойств поверхности активной области при этом был обнаружен по крайней мере один анионный центр в активной области [350, 351. Это также объясняет взаимодействие ацетилхолинэстеразы с некоторыми ка-тионоидными субстратами помимо ацетилхолина [352]. [c.136]