Холинэстеразы сыворотки крови

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Токсическое действие. Угнетает активность фермента холинэстеразы сыворотки крови. Обладает аллергенным действием. При ингаляционном воздействии сильно раздражает дыхательные пути. [c.699]

Рис. 7. Зависимость от V для ферментативного гидролиза о-нитрофенил-бутирата под действием холинэстеразы сыворотки крови человека и бутанола

Рис. 11. Зависимость l/t) от 1/[S] для ферментативного гидролиза ацетилхолина под действием холинэстеразы сыворотки крови лошади в присутствии бутанола. Над прямыми указаны концентрации бутанола (в %)

В качестве примера, иллюстрирующего применение этого метода, на рис. 29 приведены результаты исследования кинетики торможения активности холинэстеразы сыворотки крови лошади фос-форорганическим ингибитором — армином [99]. Из данных рисунка видно, что только при определенной концентрации ингибитора зависимость llv t от t является линейной. Вычисленная на основании найденной концентрации фермента и скорости гидролиза ацетилхолина величина молекулярной активности холинэстеразы оказалась равной 7-10 мин. , что удовлетворительно совпадает с результатами, полученными при использовании других методов. [c.125]

По-видимому, наиболее подробно исследована холинэстераза сыворотки крови, которая может быть получена сейчас в достаточно очищенной форме. Основные результаты измерения константы Михаэлиса (Кт) Для этого фермента при использовании в качестве субстрата ацетилхолина представлены в табл. 12. [c.158]

Константы Михаэлиса для холинэстераз сыворотки крови (субстрат — ацетилхолин) [c.158]

Зависимость константы Михаэлиса и максимальной удельной скорости гидролиза от строения субстрата холинэстераза сыворотки крови (pH 8,0, температура 25°) [c.160]

Холинэстераза сыворотки крови лошади [c.162]

При исследовании температурной зависимости кинетики каталитического действия холинэстеразы сыворотки крови лошади (частично очищенный препарат) на гидролиз различных по структуре субстратов мы получили значения максимальных (удельных) скоростей и констант Михаэлиса, представленные в табл. 21 [71]. В этой же таблице приведены величины энергии активации, рассчитанные по уравнению Аррениуса. [c.177]

Рис. 44. Зависимость V от 1/Т для ферментативного гидролиза эфиров холина при действии холинэстеразы сыворотки крови лошади

На основании результатов исследования зависимости скорости гидролиза ацетилхолина (при его нескольких концентрациях) от концентрации ингибитора были рассчитаны константы ингибиторов Ki) для тетраметил- и тетраэтиламмония. В качестве ферментов использовались частично очищенные препараты холинэстеразы сыворотки крови лошади и ацетилхолинэстеразы бычьих эритроцитов. [c.188]

При измерении констант скорости взаимодействия ингибиторов Гд-7 и Гд-42 (см. стр. 219) с холинэстеразой сыворотки крови лошади и ацетилхолинэстеразой эритроцитов было установлено, что антихолинэстеразная активность ингибиторов, не содержащих катионной группы, в отношении обоих типов эстераз примерно одинакова (табл. 30). Появление катионного центра в молекуле ингибитора увеличивает реакционноспособность в различной степени. В случае холинэстеразы активность увеличивается в 160 раз, в случае ацетилхолинэстеразы — в 3500 раз (табл. 30). [c.222]

Как следует из полученных данных, значительные изменения в структуре фермента должны происходить при взаимодействии с ионом тетраметиламмония, имеющим большее сходство с ацетилхолином, чем ион тетраэтиламмония. Видно также, что эти изменения в большей мере выражены для холинэстеразы сыворотки крови, чем для ацетилхолинэстеразы эритроцитов. [c.191]

Ацетилхолин и ионы тетраалкиламмония, как было показано выше, образуя комплексы с холинэстеразами, вызывают существенное уменьшение энтропии. Если это связано с созданием более стабильной конформации белковой молекулы, то можно ожидать защитный эффект соединений этого типа против тепловой инактивации. Эксперименты подтверждают такое предположение. На рис. 53 и 54 показано защитное действие тетраметиламмония (ТМА) и тетраэтиламмония (ТЭА) при тепловой инактивации ацетилхолинэстеразы эритроцитов (рис. 53) и холинэстеразы сыворотки крови (рис. 54) (очищенные препараты ферментов). Тепловая инактивация проводилась при pH 7,5 в течение 20 мин. в отсутствие ионов тетраалкиламмония, а также в их присутствии в разных концентрациях (показаны на оси абсцисс). Для выяснения специфичности действия аналогичные опыты проводились с КВг (в тех же концентрациях). Температура инактивации ацетилхолинэстеразы 51, холинэстеразы— 58° С. Замечено, что ацетилхолинэстераза менее термоустойчива, чем холинэстераза 50%-ная инактивация достигается соответственно при 49 и 56,5° С. [c.192]

Кинетика взаимодействия ФОС с холинэстеразой сыворотки крови лошади (очищенный препарат фермента) изучалась потенциометрическим методом при условии избытка ингибитора по отношению к ферменту в присутствии ацетилхолина в концентрации 7,5-10 при постоянном значении pH 8,0. Скорости реакции измерены в интервале температур 15—40° С. Бимолекулярные константы скорости рассчитывались по уравнению [c.206]

Результаты кинетического изучения взаимодействия исследованных ФОС с холинэстеразой сыворотки крови лошади, а также [c.220]

Холинэстераза сыворотки крови. . . 0,9-10 1,45-10е 160 [c.222]

Рис. 62. Зависимость кажущейся величины от Концентрации тетраэтиламмония. Ингибитор Гд-42. Фермент холинэстераза сыворотки крови

Концентрация ( H,)i N+, М Ацетилхолинэстераза эритроцитов Холинэстераза сыворотки крови [c.225]

При остром отравлении — одышка, хрипы, нарушение координации движений, сужение зрачков, судороги, понос, падение, а затем повышение кровяного давления, нарушение сердечной деятельности, парез задних лап, гибель в течение суток, при подостром — эритропения и лейкоцитоз. При введении дробленого тиоцианата натрия — повышение активности транса миназ и угнетение ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстераз сыворотки крови, увеличение содержания сахара и остаточного азота в крови. Максимальное содержание тиоцианатов в крови через сутки после отравления. На вскрытии— поражение слизистой тонкого кишечника, печени, почек, селезенки, отек легких. При повторном введении крысам и кроликам МНаЗСЫ и К5СМ по 0,5 мг/кг — снижение содержания холестерина в крови, нарушение функции печени, почек. Характерна способность тиоцианатов угнетать щитовидную железу. Многие симптомы их хронического воздействия объясняются недостатком гормонов. Патоморфологически — дистрофические изменения в печени, почках, сердце, слизистой желудка, кишечника, атрофия [c.353]

Рис. 2. Зависимость скорости гидролиза бутирилхолина под влиянием холинэстеразы сыворотки крови лошади от концентрации субстрата pH 7,5 I = 25°

Для многих неосложненных ферментативных реакций эта зависимость строго выполняется, что свидетельствует о правильности положенных в основу теории представлений о механизме процесса. Для иллюстрации на рис. 2 показана такая зависимость стационарной скорости гидролиза бутирилхолина при действии холинэстеразы сыворотки крови лошади [2]. [c.41]

Рис. 3. Зависимость I/o от 1/[5] для гидролиза бутирилхолина под влиянием холинэстеразы сыворотки крови лошади (по данным, приведенным на рис. 2)

Мэйн [11] исследовал ферментативный гидролиз о- и п-нитро-фенилбутиратов, катализируемый холинэстеразой сыворотки крови (использована сыворотка крови человека). [c.53]

В нашей лаборатории был исследован фермент, близкий тому, который изучал Мэйн,— очищенный препарат холинэстеразы сыворотки крови лошади. Однако в качестве субстратов были избраны [c.54]

В опубликованной нами работе [67 ] подробно проанализирована кинетика гидролиза индофенолацетата под влиянием холинэстеразы сыворотки крови лошади (см. ниже) и разработаны основы автоматизированного метода определения активности этого фермента [68]. Сущность метода заключается в следующем. Принципиальная схема (рис. 40) прибора построена на основе электрофотоколориметра ФЭКН-54, катодного повторителя и электронного потенциометра ЭПП-09, соединенных по схеме, описанной В. В. Александровым и М. Т. Бороком [69] для спектрофотометрического определения азота в аргоне. Свет от лампы накаливания 7, пройдя через линзы 2, зеркала 3, светофильтры 4, кюветы 5, оптический клин 6 и щелевую диаграмму 7, попадает на фотоэлементы 8. Напряжение с сопротивления, включенного в цепь фотоэлементов, подается на ка- [c.155]

Рис. 41. Кинетика гидролиза индофенилацетата при действии холинэстеразы сыворотки крови лошади (регистрация самописца на ленте прибора [рис. 40])

Обращает на себя внимание тот факт, что в целом холинэстеразы сыворотки крови различных животных характеризуются близкими значениями констант Михаэлиса — около (1,2—1,4)-10 М. Величина 3,2-10- М, найденная Августинссоном [11] манометрически, по-видимому, преувеличена. Для той же холинэстеразы сыворотки крови лошади в наших лабораториях двумя разными методами (потенциометрическое титрование при постоянном pH и концентрации субстрата [57] и при помощи регистрирующего рН-метра по скорости уменьшения pH [71]) получены близкие значения. [c.158]

Михаэлиса для четырех известных субстратов одним и тем же методом и при строго одинаковых условиях [71]. Исследована кинетика ферментативного гидролиза ацетилхолина, ацетил-Р-метил-холина, бутирилхолина и бензоилхолина, катализируемого холинэстеразой сыворотки крови лошади (очищенный препарат фермента с уд. активностью по ацетилхолину 4,3 Е/мг при температуре 25°, pH 8,0 и концентрации Na l в среде 6,05 М). Для измерения начальной скорости реакции использован потенциометрический метод с регистрирующим рН-метром. [c.160]

В гл. V (см. стр. 53) был описан один из методов, который позволяет измерить константу субстрата К ), константу Михаэлиса и остальные константы скорости гидролиза нитрофенилбутиратов при действии холинэстеразы сыворотки крови лошади. [c.163]

Работы по очистке холинэстераз начали публиковаться в 1935 г. Первоначально были получены препараты холинэстеразы сыворотки с активностью, лишь в 50—100 раз превышающей активность исходного материала [80, 81]. В 1944 г. Стрелиц [82] удалось довести степень очистки холинэстеразы сыворотки крови до 5000 и получить препараты с удельной активностью 3,6-10 /жг. [c.164]

В последние годы в связи с развитием новейших методов фракционирования белков (хроматография на ионитах, препаративный электрофорез и т. п.) получены еще более активные препараты холинэстеразы сыворотки крови [83, 84]. Наибольшей активностью характеризуются препараты, полученные Янцем и Коэном [83] (уд. активность 10 /жг). По обычно принимаемым для белков критериям (кривые седиментации в ультрацентрифуге, электрофорез) эти препараты представляют собой индивидуальные белки с коэффициентом седиментации S o 9,9. [c.164]

При исследовании взаимодействия фосфорорганических ингибиторов с холинэстеразами было установлено, что каждая молекула ингибитора реагирует с одним активным центром фермента, т. е. что реакция ингибирования фермента является бимолекулярной (см. ниже, стр. 205). Используя кинетические закономерности для бимолекулярных реакций при эквимолекулярных концентрациях реагирующих веществ (см. стр. 124), можно экспериментально определить молярную концентрацию фермента [99]. Так, при исследовании кинетики ингибирования холинэстеразы сыворотки крови лошади (частично очищенный препарат) о-этил-п-нитрофенилэтил-фосфонатом — армином (см. формулу I) были получены кинетические кривые, часть которых приведена на рис. 29. Для концентрации фермента, соответствующей скорости гидролиза ацетилхолина [c.166]

Полученное нами значение молекулярной активности холинэстеразы сыворотки крови лошади несколько отличается от величины, измеренной другими авторами. Так, Берри [100] при определении молекулярной активности холинэстераз, исходя из того же представления о стехиометрических отношениях при действии фосфорорганических ингибиторов, исследовал зависимость между степенью снижения активности фермента (Ди) и концентрацией добавленного ингибитора [I]. В качестве ингибиторов автором были использованы дициклогексилфторфосфат (формула П1) и диэтил-я-нитрофенилфосфат (формула IV) . [c.167]

При этом для холинэстеразы сыворотки была получена величина Ум 9,35-10 jKWH- (pH 7,2—7,4 температура 38°, манометрический метод определения активности). Значения Ум для холинэстераз сыворотки крови других животных приведена в табл. 16. [c.167]

Авторы использовали взаимодействие препаратов частично очищенных ферментов с диизопропилфторфосфатом, содержащим радиоактивный изотоп Р , и определяли степень снижения активности ферментов и фактическое количество присоединившихся молекул ингибитора (по Р ). Для учета неспецифического присоединения ингибитора к посторонним белкам проводилась реакция в условиях защиты фермента субстратом. При этом для холинэстеразы сыворотки крови лошади была получена величина Um 5-10 мин (температура 38°, pH 7,4). Возможно, что несколько меньшая величина Ум, полученная Коэном и сотрудниками, объясняется неполной защитой холинэстеразы субстратом от ингибирующего действия диизопро-пилфторфосфата (см. ниже). [c.167]

В 1962 Г. Янц И Коэн [83], используя при исследовании высоко-очищенной холинэстеразы меченый днизопропилфторфосфат, получили значение молекулярной активности Ом 8,4-10 мин (pH 7,5 температура 25° автоматический титратор). По-видимому, эта величина более точна. Между прочим, она близка к значению молекулярной активности холинэстеразы сыворотки крови лошади, определенной еще в 1936 г. Иссопом и Стедманом [16]. [c.168]

Рис. 48. Зависимость скорости гидролиза индофенилацетата от pH для холинэстеразы сыворотки крови / — ферментативный гидролиз 2 — неферментативный гидролиз

Расчеты показали, что холинэстераза имеет в активном центре одну анионную группировку (заряд = —1), а ацетилхолинэстераза — две (заряд = —2). Однако исследованиями Шукудза и Шинода [122] установлено, что действие, например, тетраэтиламмония на оба типа холинэстераз характеризуются близкими кинетическими и термодинамическими константами. Так, значения рК/ для холинэстеразы сыворотки крови и эритроцитов равны 3,88 и 3,91, а теплота диссоциации комплексов фермент-ингибитор—6,0 и 6,5 ккал моль. На основании полученных данных авторы приходят к выводу [c.194]

Для выяснения этого вопроса проводилось исследование кинетики ингибирования холинэстеразы сыворотки крови и ацетилхолинэстеразы эритроцитов тремя ФОС в присутствии тетраметиламмония и тетраэтиламмония [170]. При этом были взяты два необратимых ингибитора, которые должны взаимодействовать лишь с нуклеофильной группировкой активных центров эстераз — соединение Гд-7 (XXVI) и диизопропилфтор-фосфат (ДФФ) (XXXIII) [c.224]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология