Третичная структура ферментов

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Вполне уместно завершить эту книгу разделом о кристаллизации ферментов, поскольку получение кристаллов част представляет собой конечную стадию очистки и изучения фермента. Часть этого раздела следовало бы поместить в гл. 3,, потому что кристаллизация как метод осаждения—это очень-хороший и часто используемый способ очистки ферментов. Но-все же более уместно обсудить его в общих чертах в этом разделе. Кристаллизация играет важную роль в научных исследованиях по меньшей мере четырех типов она используется -1) как метод очистки ферментов, 2) для подтверждения гомогенности ферментных препаратов, 3) как метод стабилизации ферментов при хранении и 4) для определения третичной структуры ферментов методом рентгеноструктурного анализа. [c.332]

Эффект деформации фермента (эффект вынужденного , или индуцированного контакта) — каталитически активная конформация фермента, возникающая лишь в момент присоединения молекулы субстрата. В современных теориях ферментативного катализа большое значение придается гибкости третичной структуры фермента, в особенности динамическим изменениям пространственной и электронной конфигурации фермент-субстратного комплекса в переходном состоянии. [c.141]

Алкогольдегидрогеназа представляет собой особый фермент в том смысле, что каждая субъединица содержит два Zn +, один из которых физически стабилизирует третичную структуру фермента благодаря связям с лигандами — сульфгидрильными группами остатков цистеина в положениях 97, 100, 103 и 111,— а другой, участвующий в каталитическом цикле, связан с сульфгидрильными группами цистеиновых остатков в положениях 46 и 174 и с имидазольной группой гистидина-67 четвертое координационное положение этого атома заполнено молекулой воды или гидроксидным ионом. Присоединение NAD+ к ферменту вызывает выброс протона в соответствии с механизмом, схема которого приведена на рис. 13.6. Цикл каталитической реакции показан на рис. 13.7. [c.469]

Необходимо представлять, что одной из основных задач в этой области является развитие методов стабилизации фермента в нативной форме П23]. Значительный прогресс в этой области достигнут путем использования бифункциональных реагентов для сшивания пептидных цепей, определяющих третичную структуру фермента. [c.258]

При изучении механизма химической реакции, катализируемой ферментами, исследователя всегда интересует не только определение промежуточных и конечных продуктов и выяснение отдельных стадий реакции, но и природа тех функциональных групп в молекуле фермента, которые обеспечивают специфичность действия фермента на данный субстрат (субстраты) и высокую каталитическую активность. Речь идет, следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры фермента, а также химической природы того участка (участков) молекулы фермента, который обеспечивает высокую скорость каталитической реакции. Участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов часто имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов, поэтому было высказано предположение, что при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об активном центре фермента. Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа (рис. 4.2). Установлено, что у сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы. [c.122]

До сих пор в энзимологии обсуждалась главным образом последняя возможность, хотя, по-видимому, необходимо считаться с обеими, исследуя независимыми методами влияние pH на третичную структуру ферментов. [c.184]

Конкретизация представлений о механизме действия каждого отдельного фермента является исключительно трудной задачей. Для этого необходимо предварительное установление не только первичной, но также вторичной и третичной структур фермента. Последнее достигается обычно применением рентгеноструктурного анализа. В итоге создается подробная трехмерная модель молекулы фермента. Увязы- [c.431]

К значительной модификации третичной структуры ферментов. В отличие от скачкообразных изменений, происходящих при распаде четвертичных агрегатов, структурные (и функциональные) изменения, наблюдаемые при воздействии температуры на третичную конформацию, не столь значительны и носят характер постепенных сдвигов. По-видимому, изменение третичной структуры происходит в довольно широком диапазоне температур, и оно часто приводит лишь к изменению, но не к утрате каталитической способности. [c.220]

Имеющая определенную конформацию (определенную вторичную структуру) цепь может далее складываться с созданием третичной структуры. Например, на рис. 35 изображена третичная структура фермента рибонуклеазы, представляющей собой полипептид, построенный из 124 аминокислотных остатков. [c.428]

Изменение заряда аминокислотных заместителей в полипептидной цепи относится к числу сильных воздействий на белковую молекулу, поэтому изменение pH раствора приводит к существенному изменению почти всех физико-химических свойств и третичной структуры фермента вплоть до необратимых изменений конформации белковой глобулы при крайних значениях pH. Обычно существенные конформационные сдвиги заметны уже при изменении pH на несколько единиц, а такие белки, как цитохром с, не денатурирующие при значениях pH от 2 до 12, встречаются крайне редко. [c.73]

Что касается температурной зависимости скоростей ферментативных реакций, то этот вопрос также достаточно сложен, и здесь встречается ряд дополнительных трудностей по сравнению с обычными каталитическими процессами, поскольку ко всему прочему в этом случае приходится сталкиваться с проблемой термолабильности белковых глобул. От температуры зависят не только константы Михаэлиса и константы скорости распада фермент-субстратных комплексов, но и положение оптимума pH. С температурой изменяется третичная структура фермента, а при повышенных температурах наблюдается тепловая денатурация белковых глобул. При соответствующей постановке экспериментов некоторые из этих факторов можно изучить [c.77]

Ряд экспериментов показывает, что в фермент-субстратном комплексе наблюдается два одновременно быстро протекающих процесса. Первый — изменение электронной плотности комплекса, вызывающее поляризацию связей, и второй — геометрическая деформация (напряжение) отдельных валентных связей как в молекуле субстрата, так и в активном центре белка-фермента. Оба эти фактора — деформация и поляризация ковалентных связей повышают термодинамический потенциал этих связей, т. е. способствуют преодолению активационного барьера переходного состояния фермент-субстратного комплекса. Таким образом, в современных теориях ферментативного катализа большое значение придается гибкости третичной структуры ферментов и, [c.140]

Рис. 20-7. Модель, изображающая третичную структуру фермента лизоцимхло-рида (установлена в результате предварительного исследования методом рентгеноструктурного анализа).

Типичная зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 8.12. Видно, что при некой оптимальной температуре скорость реакции максимальна. Повышение скорости реакции по мере приближения к оптимальной температуре слева объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул. При дальнейшем повышении температуры кинетическая энергия молекулы фермента становится достаточной для разрыва связей, поддерживающих вторичную структуру фермента в нативном, каталитически активном состоянии (происходит тепловая денатурация фермента). Вторичная и третичная структура фермента разрушается, что сопровождается потерей каталитической активности. [c.82]

Характерной особенностью третичной структуры ферментов. является то, что их активный центр и регуляторный участок (один или несколько) взаимодействуют лишь с небольшим числом соединений (лигандов), которые являются либо субстратами, либо эффекторами обратимого или необратимого типа. Очистка ферментов с помощью аффинной хроматографии основана на специфическом узнавании этих участков и возможна лишь в том случае, если активный участок обладает высоким сродством к лиганду, если связывание лиганда с участком- обратимо и если в данных условиях после сшивания лиганда с матрицей никакой другой реакции не происходит. [c.101]

Аминокислотные остатки, образующие каталитический центр однокомпонентного фермента, расположены в различных точках единой полипептидной цепи (см. рис. 34). Поэтому каталитический центр возникает в тот момент, когда белковая молекула приобретает присущую ей третичную структуру. Следовательно, изменение третичной структуры фермента под влиянием тех или иных факторов может привести к деформации каталитического центра и изменению ферментативной активности. [c.99]

В процессе образования фермент-субстратного комплекса и на дальнейших фазах ферментативного катализа происходят неоднократные изменения третичной структуры фермента, приводящие к последовательному сближению с субстратом и ориентации в пространстве тех активных групп, которые взаимодействуют друг с другом на различных этапах преобразования субстрата. Изменение третичной структуры белка невозможно без участия всей или почти всей полипептидной цепи, образующей белковую молекулу. Следовательно, в каталитическом акте принимает участие по существу вся или почти вся молекула фермента. [c.104]

Успехи в изучении етруктуры белков, н в частности лизоцима, в кристаллическом состоянии методами рентгеноструктурного анализа неизбежно повлекли за собой вопрос о том, насколько третичная структура фермента, и в особенности его активно1 о це1гтра, в кристалле близка к таковой в растворе. С одной стороны, можно было бы ожидать близкое сходство, если не идентичность, между структурами фермента в данных двух физических состояниях, поскольку по меньшей мере одна треть объема для большинства кристаллических белков занята водой [35], причем по данным ЯМР эта вода имеет жидкую структуру [36]. С другой стороны, определенные ограничения в подвижности фермента в кристалле, а также взаимные стерические влияния молекулы в кристаллической решетке (возможно, различные для разных полиморфных модификаций кристаллического фермента) могут, вообще говоря, сказываться на топографии активного центра, доступности его по отношению к молекулам субстрата и эффекторов и в целом на механизме ферментативного катализа. [c.155]

Обращает на себя внимание необычно высокая положительная величина А5 для миозина (аденозинтрифосфатазы). Такое изменение энтропии, согласно результатам исследования Лейдлера, Оллета и Моралеса [1], объясняется по крайней мере двумя причинами а) нейтрализацией положительного и отрицательного зарядов при взаимодействии фермента с субстратом, сопровождающейся дегидратацией ионов б) существенными конформационными изменениями третичной структуры фермента при комплексообразовании. Исследование влияния температуры на скорость отдельных стадий ферментативной реакции базируется на теории переходного состояния. Согласно этой теории, взаимодействующие молекулы при их сближении образуют переходное состояние (переходный или активированный комплекс), причем между исходным и переходным состоянием устанавливается динамическое равновесие. Вместе с тем, переходный комплекс претерпевает непрерывное превращение с образованием продуктов реакции. С этой точки зрения простейшую ферментативную реакцию Е + З ЕЗ- Е + Р следует рассматривать как многостадийную [c.131]

Третичная структура фермента карбоксинептидазы была определена методом дифракции рентгеновских лучей. Этим же методом был исследован препарат фермента, кристаллизованный вместе с аналогом субстрата, связанным с его активным центром. Как и предсказывалось гипотезой индуцированного соответствия, конформация фермента изменилась некоторые аминокислотные остатки оказались смещенными на целых 14 А. При этом они приблизились к аналогу субстрата. С помощью такого исследования можно однозначно идентифицировать функциональные группы фермента, принимающие участие в катализе это значит, что в конце концов мы сможем понять, почему ферменты являются самыми эффективными из всех известных катализаторов. [c.402]

Во МНОГИХ ферментативных реакциях имеются стадии, характеризующиеся такими величинами А5, которые значительно превышают величины, ожидаемые на основе представлений об электростатических взаимодействиях или простых эффектах отбора . Так, например, А5 деацилирования ацетил-а-химотрипсина составляет примерно —36 э. е. [22]. Можно представить себе несколько возможных причин этого явления, но экспериментальное исследование каждой из них в отдельности пока неосуществимо. Одна из возможностей состоит в том, что молекула фермента претерпевает ка-кое-то конформационное изменение [23]. Такой эффект предусматривается в гипотезе принудительного контакта Кошланда [24], согласно которой конформационные изменения, возникающие в молекуле фермента при образовании комплекса с субстратом, обеспечивают необходимое расположение каталитических групп. Как отмечают Бендер и сотр. [22], принудительный контакт должен привести к существенному повышению энтропии активации, величину которого нельзя предсказать на основе структуры субстратов. Возможно, дальнейшие более точные измерения энтропии активации позволят оценить роль этого эффекта по сравнению с другими эффектами, обсуждаемыми ниже. В этой же связи следует упомянуть, что. согласно предположению Хаммеса [25], изменения третичной структуры фермента при ком-плексообразовании дают вклад в каталитический эффект за счет того, что освобождающаяся при это.м энергия частично компенсирует энергию активации, необходимую для взаимодействия субстратов. [c.111]

Сульфгидрильная функциональная группа белков играет, как известно, важную роль в механизмах функционирования определенных ферментов. Поскольку большинство этих ферментов содержит несколько 5Н-групп, идентифицировать именно ту сульфгидрильную группу, которая непосредственно осуществляет каталитическую функцию, и определить ее место в аминокислотной цепи — довольно трудная задача. В некоторых благоприятных случаях каталитически активная 5Н-группа оказывается также наиболее химически активной, что может быть обусловлено ее незащищенным положением в третичной структуре фермента или ее окружением. Добавление одного эквивалента реагента на 5Н-группу, меченного радиоактивным изотопом, должно привести к тому, что помстится интересующая нас ЗН-группа. Однако 5Н-группа в активном центре может обладать такой же или меньшей реакционной способностью по сравнению с другими 5Н-групнами, и ее удается пометить лишь при помощи какого-нибудь остроумного метода. Если 5Н-груп-па, непосредственно участвующая в каталитическом акте, защищена субстратом от алкилирующих агентов, то после предварительного алкилирования всех остальных 5Н-групп в присутствии субстрата и последующего удаления избытка немеченого алкилирующего агента и субстрата ее можно пометить алкилирующим соединением, содержащим радиоактивную алки-лирующую группу. Этот прием используют только с нативным ферментом, поскольку добавление денатурирующего агента приводит к изменению укладки полипептидной цепи и нарушению специфической конформации активного центра, в результате чего субстрат не в состоянии защитить каталитически активную 5Н-группу, Алкилирующими агентами, удобными для проведения такого рода экспериментов, оказал ись С-иодацетамид и [c.479]

Отмеченные Кошлендом [10] и подтвержденные сейчас экспериментально изменения третичной структуры фермента под влиянием субстрата кажутся сейчас наиболее вероятным механизмом создания высокой субстратной специфичности. Однако в отличие от идей Кош-ленда динамическую структуру глобулы скорее можно считать защитным механизмом, т. е. причиной, усиливающей субстратную специфичность, но не механизмом активации фермента. [c.280]

Все а-амилазы из различных источников содержат кальций (1 атом на молекулу), что доказано потерей ферментативной активности при обработке фермента агентами, связывающими металл, а также с помощью спектрального анализа Удаление кальция из молекулы амилазы приводит к лабилизации фермента, к легкости коагуляции. Предполагают, что кальций стабилизирует вторичную и третичную структуры фермента, поддерживая макроструктуру, присущую его активной форме. Устойчивость природной а-амилазы к различным эндопецгидазам позволяет предположить, что она существует в виде компактной складчатой структуры. [c.301]

Участие минеральных веществ в ферментативном катализе. Действие более четвертой части известных в настоящее время ферментов тем или иным образом связано с металлами. В большинстве случаев ионы металлов вступают в непрочную связь с апоферментом, образуя с ним легко распадающийся комплекс. В виде комплекса с металлом Армент проявляет максимальную активность, приобретая соответствуюыцто пространственную конфигурацию. Таким образом, здесь ионы металлов выступают как организаторы третичной структуры фермента, в частности как организаторы активных центров ферментов. Именно так обстоит дело при взаимодействии ионов одновалентных металлов более чем с 60-ю и ионов цинка более чем с 30-ю ферментами животного, растительного и бактериального происхождения. Велика роль отдельных катионов в формировании ферментов—мультимеров, где связь между отдельными протомерами осуществляется при участии ионов металлов. К числу таких катионов относятся Са и др. Особенно подробно в указанном смысле изучена а-амилаза. В присутствии Са " стабилизируются третичная и четвертичная структуры этого фермента, устойчивые по отношению к пептидгидролазам желудочно-кишечного тракта. [c.436]

Итак, можно обсудить роль остатков цистеина-П в ката- лизе. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что остатки цистеина-П располагаются в непосредственной близости к субстратсвязывающему участку, но не в самом участке. Они могут участвовать в связывании промежуточных продуктов и быть расположены в каталитическом участке. Доказательства этому еще нет, а непосредственное участ 1е остатков цистеина-П изучается в настоящее время. Однако мы можем предположить локализацию цистеина-П в третичной структуре фермента. В соответствии с данными, приведенными яа рис. 85, и некоторыми другими данными альдолаза претерпевает конформационные изменения в присутствии субстрата и фосфата. Разумно предположить поэтому, что защитное действие фосфата при алкилирова-нии отражает положение остатков цистеина-П в пространственной структуре комплекса альдолаза—фосфат. Более того, кинетический анализ показывает, что алкилирование остатков цистеина-П следует за алкилированием остатков цистеина-1 даже в отсутствие субстрата или фосфата. Эти данные согласуются с предположением о том, что остатки цистеина-П не располагаются на поверхности белка. По-видимому, они находятся весьма близко к поверхности, возможно в углублении, и полностью подвергаются действию карбоксиметилирующего агента после блокирования остатков цистеина-1. [c.372]

Гексокиназа индуцированное соответствие. Имеются веские данные в пользу того, что в гексокиназе дрожжей, которая фосфорилирует глюкозу с участием концевого фосфата молекулы АТР, достигается индуцированное соответствие между ферментом и субстратом. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, связывание как сахара, так и нуклеотида вызывает существенные изменения в третичной структуре фермента. Кроме того, присоединение нуклеотида к одной из форм фермента облегчается связыванием сахара [24, 25]. Эти результаты согласуются с результатами более ранних исследований АТРазной активности этого фермента в растворе в отсутствие глюкозы. Гексокиназа фосфорилирует глюкозу в положении 6 с Утах = 800 мкмоль-мин- на 1 мг белка и/См для АТР 0,1 мМ. В отсутствие глюкозы АТР гидролизуется с Утах = = 0,02 мкмоль-мин- на 1 мг белка и /См = 4,0мМ. Добавление ликсозы, которая не может фосфорилироваться вследствие утраты оксиметильной группы в положении 6, приводит к увеличению Утах ДЛЯ реакции с участием АТРазы в 18 раз при этом величина /См для АТР уменьшается в 40 раз, т. е. до значения /См, характерного дая фосфорилирования глюкозы [26, 27]. Ксилоза вызывает изменения в кристаллической структуре фермента, аналогичные изменениям, индуцируемым глюкозой (рис. 10.10). [c.319]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология