Анионные центры в активных центрах холинэстераз

В. А. Яковлев, детально изучавший механизм действия холинэстераз, считает доказанным, что в состав активного центра входит серии, гидроксил которого принимает в катализе непосредственное участие. Гидроксил должен быть специфически активирован. Активация предположительно достигается его взаимодействием с группой гистидина белка. Вторая часть каталитически активного участка фермента представляет собой анионную группировку, несущую единичный отрицательный заряд. [c.124]

Влияние анионной группировки активного центра холинэстераз на реакционную способность нуклеофильной группировки [c.224]

Из результатов исследования рН-зависимости действия холинэстераз следует, что активность ферментов связана с функциями группировки, рк которой составляет 8,5—10. К таким группировкам может быть отнесен гидроксил тирозина (см. стр. 112). Однако каких-либо прямых доказательств участия гидроксила тирозина (как впрочем и имидазола гистидина) в каталитическом действии холинэстераз нет. Вместе с тем не подлежит сомнению тот факт, что в образовании фермент-субстратного-комплекса ацетилхолин — холинэстераза участвуют в качестве обязательных не менее трех связей. Поэтому во всех современных схемах механизма действия холинэстераз фигурируют гидроксил серина, связанный с имидазолом гистидина,— в качестве постулированной Уилсоном нуклеофильной группировки эстеразного центра ионизированная карбоксильная группа — в качестве анионного центра в некоторых схемах гидроксил тирозина — в качестве кислотной группы эстеразного центра [16, 18, 141, 156]. [c.238]

На основании этих данных можно полагать, что анионный центр активной поверхности холинэстераз выполняет не только якорную функцию при взаимодействии с катионной головкой ацетилхолина (см. также стр. 237). Это взаимодействие сопровождается изменениями конформации белка в районе активного центра в направлении, благоприятствующем образованию других связей с молекулой субстрата, необходимых для каталитического эффекта. [c.193]

Однако возможно, что анионная группа активного центра холинэстераз в этом случае, как и при взаимодействии с катионами типа тетраалкиламмония, выполняет не только якорную функцию, но имеет значение также и для создания специфической структуры и повышения реакционноспособности активного центра в целом. В частности, можно было предполагать, что анионная группировка должна влиять на реакционноспособность нуклеофильной группы активного центра. [c.224]

Во-вторых, может быть высказано более вероятное предположение о том, что анионная группировка активного центра холинэстераз прямо или опосредованно, через общую структуру белка, влияет на реакционноспособность нуклеофильной группы эстераз-ного центра фермента. [c.227]

Все эти данные подтверждают предположение о том, что реакционноспособность эстеразного центра находится в зависимости от состояния анионного центра активной поверхности холинэстераз. Об этом также свидетельствуют результаты исследований по кинетике взаимодействия необратимых фосфорорганических ингибиторов с холинэстеразами в присутствии субстрата. Выше (см. стр. 118) были приведены доказательства того, что в присутствии ацетилхолина фосфорорганические ингибиторы взаимодействуют лишь со свободными активными центрами фермента. При этом под свободным активным центром подразумевался такой, у которого все группировки были свободными. [c.228]

Все эти, а также и другие кинетические данные, которые будут приведены ниже, с несомненностью свидетельствуют о том, что в активном центре холинэстераз имеется группировка анионного характера, играющая важную роль в каталитическом действии [c.187]

По-видимому, дело не только в числе анионных групп, а в различиях конформации активных центров холинэстеразы и ацетилхолинэстеразы. [c.194]

Как уже отмечалось выше, в активном центре холинэстераз, помимо нуклеофильной группировки, способной реагировать с фосфорорганическими соединениями структуры (ХИ1) с образованием фосфорильных неактивных производных, существует анионная группировка, несущая отрицательный заряд. Этот анионный центр фермента может взаимодействовать с катионным центром субстрата — ацетилхолина — в процессе катализа, а также с другими катионами, в результате чего изменяется (как правило, падает) активность фермента. В связи с этим представляют интерес два вопроса вопрос о расстоянии между анионной и нуклеофильной группировками в активном центре холинэстераз и вопрос об их взаимном влиянии. Известный вклад в решение этих проблем внесли кинетические исследования взаимодействия холинэстераз с бифункциональными фосфорорганическими ингибиторами. [c.218]

Выше было отмечено, что при реакции иона тетраалкиламмония (в составе субстрата холинэстераз или ингибитора) с анионным центром активной поверхности фермента, помимо чисто кулонов-ского взаимодействия, имеет значение строение алкильных радикалов у четвертичного атома азота. Это свидетельствует об участии определенным образом расположенных в пространстве алкильных групп при азоте в реакции с активной поверхностью холинэстераз. Возникает, однако, вопрос, какова относительная роль электро- [c.231]

Вопрос об интерпретации термодинамических констант реакций ингибирования ферментов столь же сложен, как и для реакций с субстратами, и в литературе освещен в еще меньшей степени. Имеющиеся экспериментальные данные о термодинамике взаимодействия холинэстераз с ингибиторами типа четвертичных солей алкиламмония говорят о важной роли энтропийного фактора в этом процессе, что свидетельствует о значении анионных центров фермента в поддержании его трехмерной структуры, необходимой для организации активного центра (см. стр. 190). [c.136]

На этом основании было высказано предположение, что одним из факторов, определяющих взаимодействие фермента с субстратом при образовании комплекса Михаэлиса, служит ионная реакция между катионным центром ацетилхолина и анионным центром на активной поверхности фермента. Такое взаимодействие должно быть первичным в реакции фермента с субстратом, поскольку ионные силы проявляются на большем расстоянии, чем другие виды химических взаимодействий. Образованию ионной связи приписывали лишь якорную функцию, в результате реализации которой молекула субстрата ориентируется на поверхности фермента, чем значительно облегчается образование других необходимых химических связей (уже ближнего действия) с группировками активного центра фермента. В связи с этим исследованию кинетики и механизма ингибирования холинэстераз ионами тетраалкиламмония было уделено особое внимание. Задача этих исследований — изучение особенностей строения и роли анионного центра холинэстераз в каталитическом действии указанных ферментов. [c.185]

Прежде всего было установлено, что ингибирующее действие солей тетраалкиламмония (во всяком случае низших членов гомологического ряда) является конкурентным, т. е. что они взаимодействуют в пределах активного центра обоих типов холинэстераз [126, 127]. Далее выяснилось, что ингибирующее действие ионов тетраметил- и тетраэтиламмония зависит от pH и уменьшается в области кислых значений pH (рис. 49). На этом основании был сделан вывод, что с ионами взаимодействует карбоксилат-анион, диссоциация которого подавляется в области низких значений pH [16]. [c.185]

Несомненно, что анионная группировка в активном центре ацетилхолинэстеразы играет более важную роль, чем в холинэстеразе при каталитическом действии фермента, и, как будет показано дальше, это проявляется не только в случае обратимых ингибиторов. [c.194]

VII. АНИОННЫЕ ЦЕНТРЫ В АКТИВНЫХ ЦЕНТРАХ ХОЛИНЭСТЕРАЗ [c.308]

В предыдущем разделе мы показали, что оба типа холинэстераз в основном различаются числом анионных участков в активном центре. Эта точка зрения, однако, не является общепринятой. [c.317]

Интенсивное изучение избирательности субстрата и ингибитора, кинетики гидролиза и влияния изменения pH на реакции, катализируемые холинэстеразами, дало ценные сведения о структуре активной поверхности и механизме ферментативного гидролиза. Выводы, сделанные в различных разделах данной работы, были использованы для создания общей схемы (рис. 13), иллюстрирующей возникновение соединения катионного субстрата ацетилхолина с активной поверхностью истинной холинэстеразы. На этой схеме показан двойной анионный центр — имидазольное кольцо и фенильный гидроксил, обусловливающие прикрепление субстрата за счет электростатических, ковалентных и водородных связей. Из рис. 13 видно, что гидроксильная группа серина находится в непосредственной близости от поверхности белка, но в несвязанном состоянии. Несмотря на большой труд, затраченный в этих исследованиях, предложенная схема остается гипотетической (может быть, за исключением серинового фрагмента), так как высокий молекулярный [c.324]

Вначале было установлено, что активная поверхность холинэстеразы содержит центры двух типов один был назван эстераз-ным, а другой — анионным. Анионный центр имеет отрицательный заряд и связывается с четвертичным атомом азота ацетилхолина, тем самым повышая сродство фермента к субстрату. Эстераз-ный центр завершает гидролиз специфического субстрата, а также гидролизует менее специфические субстраты, кроме этого, он является местом атаки ФОС. Эстеразный центр содержит кислотную группу, которая неактивна в виде нейтрализованной формы (сопряженное основание), и основную группу, которая также неактивна в нейтрализованном виде (сопряженная кислота). [c.29]

В связи с тем, что истинная холинэстераза содержит больше чем один анионный центр (стр. 33), представило интерес синтезировать ФОС, имеющие в своем составе две соответственно расположенные четвертичные группы. Антихолинэстеразная активность таких соединений оказалась более высокой вследствие возможности связи молекулы ингибитора с ферментом в нескольких местах. [c.119]

Исследование кинетики ингибирующего действия четвертичных солей алкиламмония позволило установить различия в свойствах холинэстеразы и ацетилхолинэстеразы. Первоначально на основании, по-видимому, ошибочных экспериментальных данных Адамс и Уиттекер [133] сделали заключение, что активный центр холинэстеразы сыворотки вовсе не содержит анионной группировки, в то время как в ацетилхолинэстеразе она имеется. Однако Бергман и Вурцель [127] в результате подробного изучения влияния ионов тетраэтиламмония и других ингибиторов на активность холинэстеразы плазмы показали, что последняя содержит анионную группировку. Блокирование этой группировки приводит к снижению каталитического эффекта. Интересно, что четвертичные соли алкиламмония тормозили ферментативный гидролиз не только катионных субстратов типа ацетилхолина, но также и субстратов, не содержащих катионного центра, например, алкилгалогенацетатов или ди-ацетина. Очевидно, такой эффект солей тетраалкиламмония связан с их влиянием на конфигурацию активной поверхности белковой молекулы. [c.193]

Стерические факторы не были детально изучены для фосфорорганических ингибиторов, но зато имеются обширные данные, полученные при исследовании специфичности на примере различных субстратов и ингибиторов, синтезированных специально для изучения природы активных центров. Данная книга не является трактатом о холинэстеразе, поэтому подробности этих исследований здесь не обсуждаются, но некоторые выводы из них играют важную роль при изучении механизма действия фосфорорганических ингибиторов. На основании ряда работ Фрисса и его сотрудников (см., например, работы [37—39]) стало очевидным, что совершенна не обязательно наличие в молекуле четвертичной группировки для взаимодействия с анионным центром фермента и карбонильной группы для реакции с его эстеразным центром. Для взаимодействия с холинэстеразой необходимо существование участка с повышенной электронной плотностью, удаленного на расстояние СНа — СНа-группы от полиметилированного атома азота (предпочтительнее четвертичного) [38]. Однако взаимодействовать с анионным центром холинэстеразы может и другая, отличная от четвертичного азота, катионная группа (например, в метилсульфате изо-систокса). [c.119]

Другие доказательства участия анионной группировки активного центра фермента в каталитическом действии холинэстераз были получены при исследовании субстратов и ингибиторов, содержащих способные к ионизации группировки. С этой целью изучалась кинетика гидролиза диметиламиноэтилацетата при различных значениях pH среды, т. е. при разной степени ионизации субстрата [c.186]

По современным представлениям активный центр холинэстераз (ХЭ) имеет два четко выраженных и пространственно разделенных пункта — анионный и эстеразный (см. рис. 1). Анионный пункт, по-видимому, образован карбокси.лат-анионом двухосновной аминокислоты или аспаргиновой, или глутаминовой. Роль этого пункта состоит в специфической сорбции триметил-аммониевой группы ацетилхолина (АХ) на поверхности фермента, что приводит к резкому повышению вероятностного фактора реакции. [c.322]

Скорость реакции с ферментом и устойчивость продуктов фосфорилирования, определяющая обратимость токсического воздействия, в значительной степени зависят от структуры исходного фосфорорганического соединения. Наиболее сильные из известных до настоящего времени ингибиторов холинэстеразы — фосфорилгсоли-иовые и фосфорилтиохолиновые производные связываются как с эстеразным, так и с анионным участками активного центра, как это [c.162]

В каталитическом действии холинэстераз обоего типа принимает непосредственное участие гидроксильная группа одного из остатков серина, расположенного на активной поверхности фермента. Однако такой гидроксил должен быть специфически активирован, чтобы приобрести способность к участию в каталитическом действии. Эта активация может быть осуществлена путем взаимодействия с группировкой белковой молекулы, характеризующейся величиной рК 5,8—7,0. Предполагают, что такой группировкой является остаток гистидина. Доказано наличие в холинэстеразах обоего типа анионной группировки, несущей единичный отрицательный заряд и взаимодействующей с катионной группировкой субстрата — ацетилхолина, а также катионсодержащих ингибиторов. В активном центре холинэстеразы вблизи серина находится остаток глутаминовой кислоты. Проведены расчеты электростатического потенциала и электрического [c.51]

Расчеты показали, что холинэстераза имеет в активном центре одну анионную группировку (заряд = —1), а ацетилхолинэстераза — две (заряд = —2). Однако исследованиями Шукудза и Шинода [122] установлено, что действие, например, тетраэтиламмония на оба типа холинэстераз характеризуются близкими кинетическими и термодинамическими константами. Так, значения рК/ для холинэстеразы сыворотки крови и эритроцитов равны 3,88 и 3,91, а теплота диссоциации комплексов фермент-ингибитор—6,0 и 6,5 ккал моль. На основании полученных данных авторы приходят к выводу [c.194]

Далее происходит синхронный электромерный сдвиг и переход протона к холину с образованием ацетилированного по гидроксилу фермента и протонированного имидазола [141]. Следующий элементарный акт с участием воды может произойти лишь после того, как молекула холина покинет анионный центр фермента. Об этом свидетельствуют результаты изучения влияния холина на деацетилирование холинэстеразы, полученные Крупкой и Лейдлером, а также А. П. Бресткиным и сотрудниками [179]. По-види-мому, для успеха атаки воды необходимо новое изменение конформации активного центра, которое наступает после диссоциации комплекса фермент — холин и восстановления отрицательного заряда анионной группировки. Молекула воды образует связь с карбонильным кислородом и кислордом тирозина, после чего происходит обратный электромерный сдвиг и переход протона от воды к тирозину и от имидазола — к гидроксилу серина. При этом выделяется второй продукт реакции — уксусная кислота — и регенерируется фермент в исходной конформации. [c.239]

Антихолинэстеразная активность ариловых эфиров М-метил-карбаминовой кислоты, содержащих в арильном остатке алкилмеркаптогруппу, сильно зависит от полярности заместителей в ароматическом остатке [1]. Наибольшую активность проявляют ортоизомеры, наименьшую — пара-изомеры. Полагают, что это связано с взаимодействием атома серы с анионными центрами холинэстеразы. [c.304]

Однако, как видно на рис. 2, эта кривая имеет растянутый максимум, расположенный между pH 7,5 и 9 (это справедливо для аце-тилхолинэстеразы, а не для сывороточной холинэстеразы) и совсем не похожа на кривую зависимости ингибирующей активности ТЭПФ от pH (см. рис. И, стр. 102). Как показали Бергманн и Шимони [14], это объясняется тем, что анионный центр так же, как и эстеразный, чувствителен к изменению pH, а основное отличие во взаимодействии этих двух веществ с активной поверхностью фермента заключается в том, что ацетилхолин реагирует с обоими центрами, а ТЭПФ только с эстеразным. Для подтверждения своей точки зрения они исследовали действие четырех ингибиторов, имеющих четвертичный атом азота, два из которых не могли реагировать с эстеразным центром, и обнаружили лишь небольшое изменение степени угнетения при возрастании pH от 7 однако при понижении pH угне- [c.31]

Величина (и, следовательно, различные возможные значения /50) для взаимодействия ингибитора с определенным видом холинэстеразы зависит от pH и температуры. Влияние изменения pH на степень угнетения холинэстеразы под действием ТЭПФ было использовано Вильсоном для выяснения строения активной поверхности истинной холинэстеразы электрического угря (рис. И). Он считает, что строение молекулы ТЭПФ не зависит от pH, а изменения, которые видны на рис. 11, отражают изменения степени ионизации активных центров фермента. Об этом было сказано выше (стр. 34). Здесь же достаточно отметить, что наличие оптимума pH для процесса торможения холинэстеразы ФОС является результатом изменений эстеразного центра. Если молекула ФОС содержит группу, которая при реакции с холинэстеразой взаимодействует с анионным центром фермента, то картина оказывается еще более сложной, так как величина заряда анионного центра тоже зависит от pH [17]. Если группа, связывающая анионный центр, является, скажем, четвертичным азотом (например, в фосфопиристигмине), то она не изменяется при сдвигах pH. Но если эта группа содержит третичный азот (как в тетраме), то ее строение (или степень ее протонизации) в большой степени зависит от pH. Такая структурная модификация приводит к изменению сродства ингибитора к активной поверхности фермента, что в свою очередь влияет на другие эффекты, вызываемые изменением pH [81 ]. [c.101]

Механизм действия активного центра эстераз состоит из двух последовательных стадий. Первая стадия — это ацетилирование нуклеофильной группировки эстераз (рис. 28). Образование комплекса Михаэлиса начинается с возникновения электростатической связи между анионным участком, и катионной группировкой субстрата. Следует отметить, что, помимо ионного взаимодействия, на этой стадии, по-видимому, значительную роль играют ван-дер-ваальсовы взаимодействия и стерический фактор. Так, например, как показали Адамс и Уиттакер [398], ацетилхолин и его структурный аналог 3,3-диметилбутирацетат одинаково хорошо гидролизуется холинэстеразой, хотя второе вещество вовсе не является катионом. [c.580]

Действие ацетилхоли н—г идролазы (ацет и л -холинэстеразы) . Активный центр ацетилхолин—гидролазы состоит из двух участков — эстеразного и анионного (см. стр. 213). При приближении ацетилхолина к ферменту происходит связывание триметил-аммониевой группы ацетилхолина с анионным участком. Это в свою очередь повышает вероятность и облегчает взаимодействие ацетильной группы ацетилхолина с гидроксилом серина эстеразного участка фермента, приводящее к разрыву связи ацетильной группы с холином и образованию ее связи с кислородом серина. В этом процессе принимают участие акцептор и донор протона. Акцептором протона является имидазольное кольцо гистидина. Роль донора предположительно отводится тирозину, находящемуся вблизи активного центра фермента (рис. 41). [c.238]

Представляет интерес сопоставить полученные д п) с аналогичными величинами для холинэстераз, в случае которых вопрос о наличии анионного "пункта" в активнее центре и взатодействии его с полокительным зарядом в отщепляемой части ФОИ и стбстоатов, разработан в литературе более подробно (ом. напр. ). [c.996]

В связи с вышеприведенной схемой (см. рис. 5.6) можно легко понять эффект ингибирования различными веществами холинэстераз. Например, соли карбаминовой кислоты (прозерин, эзерин) в низких концентрациях (10 М - 10 М) угнетают активность ферментов гидролиза холиновъг эфиров. Аминогруппа шиибитора, находящаяся рядом с карбонильной группой, связывается с анионным центром холинэстеразы, не затрагивая эстеразный центр. Ингибирование носит конкурентный характер и может быть обратным. [c.67]