Амплификация ДНК генов

Рис. 21-26. Возможный механизм амплификации гена, приводящей к избыточной продукции белка Процесс начинается с акта дупликации, в основе которого, но-видимому, лежит незаконная рекомбинация. Изображенная на рисунке схема предполагает, что незаконная рекомбинация может быть следствием дестабилизирующего эффекта избыточной репликации ДНК. Если дупликация гена произошла, неравный обмен сестринских хроматид в результате рекомбинации между одинаковыми копиями генов в ходе репликации ДНК может дополнительно увеличить число копий гена (см. разд. 10.5.2) в результате их количество в хромосоме может достигать десятков и сотен. Многочисленные повторы ДНК делают видимым содержащий их сегмент — он выявляется в хромосоме как область гомогенного окрашивания. Амплифицированный участок может быть также вырезан из своего локуса (видимо, опять же с участием какого-то из рекомбинационных механизмов) и дать начало самостоятельным двойным минихромосомам (см. разд. 21.1.13). Общая длина амплифицированного по такому механизму сегмента ДНК обычно

Один из основных путей адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды — регуля щя экспрессии генов. Этот процесс, детально изученный для бактерий и вирусов, заключается в специфическом взаимодействии определенных белков с различными участками ДНК, расположенными рядом с сайтами инициации транскрипции. Такие взаимодействия могут характеризоваться как позитивным (положительным), так и негативным (отрицательным) влиянием на уровень транскрипции. В эукариотических клетках используются и другие механизмы регуляции транскрипции. В контроле экспрессии генов могут участвовать амплификация, генные перестройки, переключение классов и посттранскрипционные модификации. [c.109]

На уровне транскрипции регуляторные механизмы у прокариот и эукариот имеют ряд общих черт. Рассмотрим некоторые отличительные особенности. Для клеток эукариот характерна амплификация генов и их перестройка. Оба механизма обеспечивают резкое увеличение копий тех или иных белков, необходимых для реализации клеточного метаболизма. [c.473]

Изменения в относительном соотношении компонентов генома иногда происходят во время соматического развития. Хорошо известно, например, увеличение числа копий определенных генов у личинок насекомых. Благодаря возможности отбирать варианты клеток с увеличенным числом копий определенного гена показана случайная амплификация генов в культуре клеток млекопитающих. Инициируемое внутри генома событие амплификации способствует созданию дополнительных копий гена, которые существуют либо в составе хромосомы, либо в форме внехромосомных элементов. [c.490]

При определенных обстоятельствах часть генома может амплифи-цироваться путем повторной репликации одного или нескольких генов. Наиболее широко известным примером является амплификация генов рибосомной РНК ооцитов амфибий. В случае Хепориз избыток ДНК скапливается вокруг ядрышка, а затем распадается, образуя 1000 или больше отдельных ядрышек. Можно обнаружить до 3000 копий рДНК (образующих при центрифугировании четкую сателлитную область). Амплифицированная рДНК может служить удобным материалом для биохимических исследований. Так, например, структурные исследования, описанные в предыдущем разделе, были выполнены на ДНК именно этого типа. [c.301]

Амплификация гена оказывает видимый эффект на хромосому локус можно идентифицировать визуально как гомогенно окрашенную область (HSR). Это показано на рис. 38.10. HSR получила свое название из-за присутствия дополнительной области, в которой хромосомные полосы при соответствующих обработках, например при С-окрашивании, выявить не удается (см. рис. 28.9). Это позволяет предполагать, что определенная область между полосами расширилась. [c.497]

В основе обсуждаемой методологии лежит феномен амплификации генов, рассматриваемый в следующем разделе. [c.239]

Методики селекции на амплификацию генов [c.245]

На первом этапе можно получить клоны с десятикратной амплификацией гена оценку производят по числу копий или по [c.248]

Ниже мы рассмотрим детально лишь факторы, имеющие, по-видимому, важное значение для выбора стратегии экспрессии гена. Это стабильность амплифицированных последовательностей в отсутствие селекции, структура вектора и частота амплификации гена. [c.260]

Причины появления в одних случаях гомогенно окрашенных районов, а в других — DM пока неясны. По-видимому, конструкция вектора здесь не играет роли, а определяющее значение имеют природа клеток-хозяев и характеристика сайта первичней интеграции. Так, например, две наиболее часто применяемые линии клеток хомяка СНО и ВНК-21 обеспечивают преимущественно стабильную амплификацию гена, а у мышиных фибробластов и некоторых линий опухолевых клеток человека преобладает DM-форма [2]. Таким образом, если во главу угла ставить стабильность амплифицированных последовательностей в отсутствие селекции, то предпочтение следует отдать клеткам [c.260]

Частота амплификации генов [c.261]

Амплификация генов в ходе развития [c.120]

Для выявления ДНК легионелл разработано несколько вариантов ПЦР, основанных на амплификации гена mip (кодирует поверхностный макрофаг-индуцирующий белок), гена цитолизина и ряда других маркеров. Наиболее широко применяется двухэтапная ПЦР-диагностика вначале — предварительное определение легионелл с универсальными для семейства праймерами (чувствительность — 30 — 50 клеток в образце), а затем проводят внутривидовую идентификацию L. pneumophila с использованием высокоспецифичных праймеров. Использование ПЦР позволяет также обнаруживать легионеллы в объектах внешней среды и изучать их связи в различных микробиоценозах. [c.138]

Выделение риккетсий на культуре ткани. Клинический материал в объеме 0,5 мл смешивают с таким же количеством среды для культуры ткани и сразу же вносят в ячейки специальных планшетов или контейнеры, где предварительно выраш,ивают монослой соответствуюш,ей культуры клеток. Планшет центрифугируют в течение 1 ч при 700 g, после чего инокулюм удаляют, тщательно промывают ячейки с монослоем фосфатным буфером, вносят в них среду МЕМ с 10 % телячьей сыворотки крови и инкубируют при 34 °С в атмосфере 5 % СОз. Через 48 и 72 ч культуральную жидкость сливают, монослой промывают, фиксируют и окрашивают соответствующими люминесцирующими сыворотками (прямая РИФ) для обнаружения возбудителя в клетках монослоя. При люминесцентной микроскопии обнаружение четырех и более характерно светящихся микроорганизмов расценивается как положительный результат. Идентификацию выделенных риккетсий проводят также методом ПЦР с амплификацией генов, специфичных для риккетсий (например, гена цит-ратсинтазы, белка 17 кДа, ОтрВ — для определения родовой принадлежности, белка ОтрЛ — для выявления риккетсий сыпного тифа). [c.236]

Продолжительная селекция на устойчивость к метотрексату позволила выделить как стабильные, так и нестабильные по этому признаку линии клеток. Какова пе.р-воначальная ступень в амплификации гена На первых ступенях отбора большинство или все резистентные клетки проявляют нестабильность. Образование внехромосомных копий явно представляет собой более частое событие, чем амплификация внутри хромосомы. Мы не знаем, происходит ли внутрихромосомная амплификация менее часто как процесс, происходящий de novo, или она связана с внехромосомной амплификацией, являющейся промежуточной ступенью процесса. Из-за неправильной сегрегации двойных микрохромосом увеличение числа копий может происходить относительно быстро в тех случаях, когда при каждом делении отбираются клетки, содержащие больше, чем положено, копий генов dhfr. Такие клетки возникают и отбираются в ответ на возросшие уровни метотрексата. Поведение двойных микрохромосом объясняет ступенчатую эволюцию признака mtx и нерегулярные колебания в уровне генов в нестабильных линиях. [c.498]

Например, многие из этих клеточных линий характеризуются избыточной экспрессией иротоонкогена туе или родственных ему генов N-тус и L-my . Часто это связано с амплификацией соответствующей области и проявляется в кариотипе как двойные минихромосомы или гомогенно окрашивающиеся хромосомные участки (рис. 21-31, см. также разд. 21.1.13). В этих же клетках гены семейства ras нередко претерпевают специфические точковые мутации. Амплификация гена туе всегда коррелирует с особенно быстрым ростом опухолевых клеток в культуре и с полным подавлением дифференцировки. Больных, имеющих опухоли с амплификацией этого гена, ждет особенно плохой прогноз. [c.478]

Размножение нормальных клеток регулируется ингибирующими и стимулирующими молекулами, которые являются соответственно продуктами генов-супрессоров опухолевого роста и протоонкогенов. Проявление раковых свойств у клетки может быть результатом как потери или инактивации обеих клеточных копий гена-супрессора, так и амплификации или гиперактивации одной из двух копий протоонкогена Наследуемые нарушения пролиферативного контроля могут быть вызваны также внедрением в клетку чужеродного вирусного генетического материала. Ретровирусы могут сами становиться онкогенными, захватывая копию клеточного протоонкогена клетки-хозяина и превращая его в онкоген они могут также создавать онкоген в клетке, действуя как инсерционный мутаген и внедряясь в ее геном рядом с протоонкогеном. Хотя полагают, что большинство онкологических заболеваний у человека вызывается не вирусами, обнаруживаемые в опухолевой ДНК мутации часто затрагивают те же протоонкогены, что и найденные при изучении ретро-вирусов. Способы превращения протоонкогенов в онкогены в опухолях у человека включают точковые мутации, амплификацию генов, а также хромосомные транслокации, которые могут привести к нарушению контроля экспрессии этого протоонкогена или к его соединению с другим геном с последующим синтезом нового белка. Подобно этому, гены-супрессоры опухолевого роста могут быть функционально утеряны в результате мутаций самого разного характера люди, унаследовавшие от родителей делецию или дефектную копию одного из таких генов, могут проявить выраженную предрасположенность к определенному типу рака, что демонстрирует пример с ретинобластомой. Молекулярнобиологический анализ опухолевых клеток от больных, страдающих одной из наиболее распространенных форм рака, выявил сложный и неоднородный спектр генетических повреждений, включая и активацию онкогенов и потерю генов-супрессоров опухолевого роста. Эти данные являются отражением случайного характера эволюционного процесса, в ходе которого возникает рак, и говорят о том, что каждая злокачественная опухоль, с молекулярной точки зрения уникальна. [c.481]

Вокмсжность вести селекцию на амплификацию гена очень удобна в целом ряде случаев. Облегчается клонирование генов, способных к амплификации, а также анализ их структуры в составе хроматина. Однако в данной главе мы ограничимся вопросами, касающимися использования феномена амплификации для осуществления избыточной экспрессии белковых продуктов. Идея заключается в том, что ко-амплификация всех последовательностей рекомбинантной конструкции при селекции на амплификацию генов-маркеров резко усиливает экспрессию любого клонированного в ее составе гена, причем повышение продукции интересующего белка часто оказывается пропорциональныхМ увеличению числа копий гена — по крайней мере до тех пор, пока не будет достигнут. максимально возможный уровень экспрессии. В экспериментах такого рода часто используется ген дигидрофолят-редуктазы в комбинации с мутантными клетками СНО, у которых нет эндогенного фермента. [c.241]

В разд. 8.2 приведены методики первичной селекции и последующей амплификации генов в векторах на основе dhfr, ada, gs и m-mtl. В разд. 8.3 обсуждаются факторы, которые следует учитывать при выборе стратегии амплификации. В разд. 8.4 onsi anbi методы аналг13а амплификации генов. [c.245]

Клоны, резистентные к С(1С12, можно сразу использовать для анализа амплификации генов (методы — см. разд, 8.4), а можно провести еще один цикл селекции при концентрациях Сс1 + от 5 до 50 мкМ. [c.250]

Появление целого ряда различных амплифицируемых векторов, описанных в разд. 8.2, позволило расширить ассортимент клеток, используемых для амплификации генов, и не ограничиваться исходными /г/г -клетками СПО ОИКХ-ВИ. В связи с этим перед исследователем встала проблема выбора клеток и векторной системы. В качестве общего правила можно рекомендовать в первую очередь рассматривать /г/г+-систему, поскольку селекция в с /1/г -клетках СНО обеспечивает высокую частоту трансфекции, а процесс амплификации вектора наиболее полно изучен именно для этих клеток. [c.258]

Оценить эффективность амплификации генов можно либо с помощью гибридизационных методов, позволяющих детектировать увеличение количества копий специфических последовательностей ДНК или мРНК, либо с помощью количественного анализа экспрессии белка. Наиболее информативно сравнение данных по всем трем контрольным параметрам (количества ДНК, РНК и белка), так как изменения этих параметров не всегда коррелируют друг с другом. Кроме того, полезную информацию может дать локализация амплифицированных последовательностей на метафазиых хромосомах с помощью гибридизации in situ например для оценки стабильности экспрессирующих клонов при культивировании в неселективных условиях. [c.262]

Сначала клетки обрабатывают колцемидом, чтобы заблокировать образование веретена зто приводит к накоплению метафазных клеток в культуре. Такие клетки имеют более округлую форму и слабее прикреплены к пластику, чем другие клетки популяции, поэтому при встряхивании флакона они легко отделяются от субстрата. Метафазные клетки затем обрабатывают гипотоническим раствором (что приводит к их набуханию), после чего фиксируют в смеси метанол — уксусная кислота. Когда суспензию таких клеток по каплям наносят на предметное стекло, клетки лопаются и хромосомы расправляются на стекле по мере высыхания раствора. Реактивы для этой процедуры приведены в табл. 8.12, а сам метод описан в табл. 8.13. На следующем этапе хромосомы обрабатывают РНКазой, чтобы исключить гибридизацию зонда с хромосомной РНК, и затем уксусным ангидридом, который ацетилирует хромосомные белки и тем самым еще более уменьшает неспецифическое связывание зонда. Хромосомную ДНК денатурируют нагреванием и гибридизуют с зондом, предварительно меченным I- TP. Избыток меченого зонда удаляют серией промывок в низкосолевом буферном растворе и покрывают препарат фотоэмульсией. После необходимой экспозиции выявляют участки образования зерен серебра, соответствующие сайтам амплификации гена. Необходимые реагенты приведены в табл. 8.14, а сама процедура описана в табл. 8.15. [c.266]

В последние годы появилась возможность вызывать амплификацию специфических областей генома культивируемых клеток м-пекопитаюших. В некоторых случаях последовательное применение увеличивающихся доз се-пективного агента приводит к амплификации специфического гена в несколько тысяч раз. Так, у онкологических больных, получавших метотрексат (противораковый препарат), развивалась устойчивость опухолевых клеток к этому лекарству. В основе этой лекарственной резистентности лежит амплификация гена дигидрофолатредуктазы, которая сама по себе является точкой приложения в терапевтическом действии метотрексата. Спонтанно произошедшая амплификация генов in vivo, т. е. в отсутствие экзогенных селективных агентов, может закрепиться в геноме при соответствующем давлении отбора. [c.121]

Г. Амплификация генов. Амплификация некоторых генов (см. гл. 38) обнаружена в клетках ряда опухолей. Как выяснилось, ее можно вызвать введением противоопухолевого препарата метотрексата— ингибитора дигидрофолатредуктазы. В результате опухолевые клетки становятся резистентными к действию метотрексата. Причиной резистентности является амплификация гена дигидрофолатредуктазы, при этом активность фермента повышается примерно в 400 раз. Амплифицированные гены, имеющие суммарную длину 1000 т. п. н. или даже больше, выявляются в виде гомогенно окрашенных участков на соответствующих хромосомах. Амплифицированные гены могут обнаруживаться также в двойных мини-хромосомах, не содержащих центромер. В настоящее время исследуется связь гомогенно окрашенных участков и двойных мини-хромосом. Процесс амплификации, а следовательно, и активации, может затрагивать и некоторые клеточные онкогены. Имеются данные, позволяющие предполагать, что увеличение количества продукта некоторых он- [c.361]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология