Экспрессия чужеродных генов в клетках

Впервые осуществлена экспрессия чужеродного гена в бактериальной клетке [c.216]

К преимуществам векторных систем на основе вирусов можно отнести следующие малый размер генома, что дает возможность легко манипулировать вирусной ДНК высокая копийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений (до 50 ООО на клетку) наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов. [c.57]

Ретровирусы можно рассматривать как природные векторы для переноса и экспрессии чужеродных генов. Ретровирусы с высокой степенью онкогенности быстро и весьма эффективно вызывают опухоли у млекопитающих и, как правило, способны трансформировать соответствующие клетки в культуре. За одним лишь исключением (разд. 9.3.3), эти вирусы дефектны по репликации, поскольку онкогенные последовательности клеточного происхождения заместили у них те вирусные последовательности, которые кодируют гранс-действующие функции [16]. Вирусные продукты, необходимые для репликации и интегра ции таких дефектных вирусов, обеспечиваются по транс-схеме не- [c.278]

Для осуществления эффективной экспрессии чужеродных генов у микроорганизмов существуют три подхода. Наиболее простой вариант — внедрение (см. рис. 5.1) чужеродного гена внутрь структурного гена. В этом случае бактериальная или дрожжевая клетка использует регуляторные элементы собственного гена. Единственное условие такого способа конструировании — встройка чужеродного гена должна быть осуществлена в правильной рамке считывания. Недостатком этого метода является производство клеткой химерного белка, из которого нужный продукт получается путем химического расщепления. Метод применен для получения ряда продуктов, особенно небольших пептидов, таких, как соматостатин. Небольшие пептиды часто являются нестабильными продуктами из-за активного протеолиза. Важно, что в составе химерных белков стабильность пептидов повышается. [c.100]

Приемы конструирования векторов, экспрессирующих рекомбинантные гены в бактериальных клетках, а также основные проблемы, возникающие при попытках экспрессии чужеродных генов в бактериях, были уже кратко рассмотрены в разделе 3.6. Здесь же мы проиллюстрируем этот материал некоторыми современными достижениями в разработке бактериальных систем экспрессии. [c.168]

Дрожжевые промоторы (см. рис. 1.8,6) существенно отличаются по строению от бактериальных промоторов. Различия в строении промоторов, а также сигналов сплайсинга (см. гл. 1) высших и низших эукариот не являются принципиальными, но, тем не менее, они не взаимозаменимы. Этим объясняются неудачи большинства опытов по экспрессии чужеродных генов с собственными промоторами в дрожжах. Поэтому для успешной экспрессии чужеродных генов в дрожжевой клетке их сигнальные последовательности, ответственные за транскрипцию и трансляцию, необходимо заменять аналогичными участками дрожжевого происхождения. [c.363]

Первое отечественное учебно-справочное пособие, в котором подробно и доходчиво рассмотрены основные понятия и методы генетической инженерии. В книге на большом числе примеров дан критический анализ подходов к клонированию и экспрессии чужеродных генов в клетках грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжах и клетках высших эукариот. Пособие подготовлено на основе лекций, читаемых автором в Новосибирском государственном университете с 1980 г [c.2]

Частным слз аем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы. Это молекулярные векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках-реципиентах. [c.32]

Таблица 12.4. Примеры экспрессии чужеродных ген-эквивалентов в составе гибридных плазмид с регулируемым промотором в клетках дрожжей-сахаромицетов

Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большого числа копий молекул нуклеиновых кислот — 10 и более молекул на зараженную клетку. Например, при репликации вируса табачной мозаики образуется 10 молекул нуклеиновых кислот (РНК) на клетку. Поэтому фргговирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чужеродного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преимуществ малый размер генома (возможность легкой манипуляции вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечивающие эффективную экспрессию чужеродных генов. [c.148]

Технология выделения и экспрессии чужеродных генов в Е. соН и в некоторых других микроорганизмах достаточно хорошо отработана, однако не стоит забывать, что синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйского организма и отрицательно повлиять на его рост. Присутствие гетерологичного белка может оказаться даже губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК, и если продуктом клонированного гена является эндонуклеаза рестрикции, то в отсутствие специальных защитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею. [c.247]

В заключение следует отметить, что хотя векторы на основе вирусов редко применяются для трансформации растений, вирусные промоторы, и прежде всего промотор 35S-PHK aMV, широко используется для экспрессии чужеродных генов в других векторных системах. Промотор 35S-PHK вируса мозаики цветной капусты является сильным промотором, кроме того, он активен не только в клетках крестоцветных, но и в клетках других семейств, не проявляет тканеспецифичности и экспрессируется во всех клетках трансформированного растения. [c.57]

Отдельно стоит проблема, возникающая при экспрессии чужеродного гена часто после двух — пяти поколений активно транскрибирующийся трансген перестает экспрессироваться. С точки зрения логики это понятно растительная клетка активно (например, из-за сильного конститутивного промотора 35S aMV) экспрессирует чуждый для ее метаболизма белок, обычно бактериального происхождения. Чаще всего инактивация трансгена происходит из-за метилирования регуляторных после- [c.75]

Однако не всегда при успешной экспрессии чужеродного гена можно получить функционально активный продукт. Дело в том, что многие эукариотические белки активируются только после их модификации (например, после протеолиза, гликозилирования, фосфорилирования и т. п.), происходящей в результате действия специфических клеточных ферментов. Но чужеродные белки могут неправильно модифицироваться или не модифицироваться вообще. Это ограничивает выбор реципиентных клеток, когда нужно получить активные модифицированные белки. В таких случаях для клонирования генов приходится использовать клетки орга низмов, родственных тем, откуда были взяты гены. С этой целью разрабатываются системы клонирования и экспрессии генов в различных семействах бактерий и низших грибов, в растительных и животных клетках ( Транскрипция и трансляция. Методы , 1987 Maximizing gene expression , 1986). [c.314]

В табл. 10.1 перечислены некоторые промоторы, используемые для экспрессии чужеродных генов в клетках Е. соИ, и указаны способы регулирования их активности. Из них наиболее часто применяются промоторы XpL, /a UV5 и trp. Их выбор был обусловлен частично историческими причинами, а также их силой и способностью к индукции. Помимо этого оказалось важным, насколько промоторы неактивны в репрессированном состоянии. Дело в том, что некоторые белки (например, инсулин) токсичны для бактериальных клеток, поэтому клонирование соответствующих генов с целью их дальнейшей экспрессии невозможно при использовании конститутивных или слабо регулируемых промоторов. Для практического применения также важно, насколько экономичен способ индукции. [c.317]

Плазмидные векторы. Как уже отмечалось, для клонирования и экспрессии генов в клетках Е. oli обычно применяют различные модификации вектора pBR322, содержащие промоторы фага Л, лактозного и триптофанового оперона и их операторные участки. Благодаря последним экспрессию клонируемых генов можно регулировать, если плазмидная или бактериальная ДНК несет гены соответствующих репрессоров. Из многих вышеперечисленных факторов, влияющих на экспрессию генов, решающими являются сила промотора и структура сайта связывания рибосом (RBS-сайта). Напомним, что этот сайт включает в себя начальные кодоны гена, поэтому нет простых путей, обеспечивающих эффективную экспрессию чужеродных генов в бактериях. Такой экспрессии добиваются двумя принципиально различными подходами (схемами) — путем [c.329]

В опытах с дрожжевыми и бактериальными клетками выяснилось, что экспрессия чужеродных генов может быть функциональной и нефункциональной. В случае функциональной экспрессии в отличие от нефункциональной чужеродные белки при подходящих условиях in vivo проявляют свою активность. В частности, некоторые бактериальные белки функционируют в дрожжах, а дрожжевые — в бактериях (табл. 11.1). [c.352]

Для достижения высокого уровня экспрессии чужеродных генов в животных клетках следует учитывать некоторые правила (Kozak, 1984 1986) [c.400]

Напомним, что вирус осповакцины развивается в цитоплазме. Поэтому в рекомбинантных вирусах важно использовать для экспрессии чужеродных генов вирусные промоторы. С помощью вирусных РНК-полимераз они позволяют избегать различных процессов, которые происходят в ядре и которые затрудняют экспрессию — сплайсинг, полиаденилирование, тоанспорт через ядерную мембрану. На порядок эффективнее промоторы фага Т7, но в этом случае в клетке должна присутствовать система, экспрессирующая РНК-полимеразу этого фага. [c.402]

Плазмиды без эукариотического репликатора. Замена в плазмидах типа pSV промотора SV40 на промотор вируса саркомы Рауса, расположенного в его LTR-повторе, дела экспрессию селектируемых генов в образовавшихся векторах pRS V-gp/n pRSV-пео еше более эффективной. Конечно, эти векторы тспользуют для наблюдения временной экспрессии. Этой же цели служат и аналогичные векторы серии pFV, предназначенные для экспрессии чужеродных генов в клетках рыб (Liu et al, 1990). Их экспрессионная кассета состоит из промотора, энхансера и интрона гена (3-актина карпа и сайта полиаденилирования гена гормона роста лосося (рис. 13.6,в). Примечательно, что эта кассета работает и в клетках животных. [c.408]

Обработка клеток ДНК в присутствии ДЭАЭ-декстрана столь же, а иногда и более эффективна, как и обработка кальцийфосфатным преципитатом ДНК в случае временной экспрессии чужеродных генов, но по неизвестным причинам выход генетически трансформированных клеток существенно ниже в первом случае [Г1, 13]. Показано, что ДЭАЭ-декстран связывается с ДНК,нейтрализуя ее заряд и изменяя конформацию молекулы ДНК, что делает последнюю устойчивой к ДНКазам и нагреванию, и, кроме того, взаимодействует с мембраной клеток, стимулируя эндоцитоз, причем сам ДЭАЭ-декстран не проникает в клетки [23, 24]. Оптимальные концентрации векторной ДНК и ДЭАЭ-декстрана различаются для клеток разных линий. Как и при введении ДНК в комплексе с фосфатом кальция, обработка клеток мембранотропными агентами (ДМСО, глицерином или ПЭГ [25]) или изменение иных условий (например, обработка клеток в суспензии, а не в монослое [13, 26] или культивирование их в атмосфере с 2 %, а не с 5—10 % СОг [27]) может повысить эффективность введения чужеродных генов в соматические клетки. [c.207]

ВИДНЫХ фагов используют для экспрессии чужеродных генов в клетках Е. oli. Особое направление исследований, использующее векторную систему нитевидных фагов, получило название фаговый дисплей. [c.118]

Таким образом, проблема создания векторов, обеспечивающих правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках Е. oli, в целом решена. Однако это не означает, что не будут создаваться новые, более эффективные векторы экспрессии, в том числе обеспечивающие секрецию целевых белков из цитоплазмы клетки. [c.130]

Иногда для экспрессии чужеродных генов в Е. oli необходимо использовать сильные промоторы, функционирование которых подвергается регуляции. Прежде всего это требуется в тех случаях, когда продукт клонированного гена токсичен для клеток Е. соИ. При этом клетки можно культивировать до определенного момента в условиях, когда транскрипция клонированного гена репрессирована, а затем индуцировать эффективную транскрипцию. Такой подход позволяет вырастить клетки, содержащие гибридные ДНК, до достаточно высокого титра и лишь после этого инициировать продукцию белка, сверхсинтез которого приводит к гибели бактериальных клеток. Кроме того, известно, что интенсивная транскрипция, направляемая сильным промотором, может отрицательно сказываться на эффективности репликации плазмидной ДНК, а это приводит к нестабильности поддержания плазмиды и постепенной ее элиминации из бактериальных клеток. Такие плазмиды могут быть стабилизированы, если дис-тально от сильного промотора встроить эффективные сигналы терминации транс1фипции. [c.146]

Многочисленными исследованиями установлено, что жесткие ограничения на экспрессию чужеродных генов в клетках грамположительных бактерий налагает организация их бе-локсинтезирующего аппарата. Так, например, в рибосомах грамположительных бактерий отсутствует белок S1, который является наиболее крупным рибосомным белком грамотрицательных бактерий. Полагают, что белок S1 обусловливает связывание молекул РНК с рибосомой и перенос мРНК в сайт декодирования рибосомы. В отсутствие данного белка значительно [c.263]

Возможен и другой подход к оптимизации экспрессии чужеродных генов в клетках В. subtilis. Изучаемый структурный ген соединяют с синтетическим сегментом ДНК, кодирующим участок связывания рибосом, специфичный для бацилл. Такую конструкцию затем можно помещать под контроль разнообразных промоторов. В частности, используя различные синтетические сегменты ДНК, содержащие SD-последо-вательности, Дж. Флок с соавторами (1984 г.) получили гибридные плазмиды, которые в клетках В. subtilis направляли синтез поли-пептидного гормона человека урогастрона в свободном виде. Данный прием является достаточно общим и может быть использован при клонировании в клетках бацилл любых генов. [c.267]

Все больший интерес вызывает создание управляемых экспрессирующих систем, так как конститутивная экспрессия чужеродного гена, клонированного в многокопийной плазмиде, приводит, как правило, к заметному метаболическому сдвигу в трансформированной клетке. В зависимости от природы гетерологичного продзто а этот сдвиг может осложняться токсическими эффектами, различными как по механизму, так и по степени тяжести. В идеале включение экспрессии целевого клонированного гена должно происходить в тот момент, когда культура дрожжей выращена до достаточно высокой плотности. При этом запускающий такую [c.314]

Многие вопросы, касающиеся экспрессии чужеродных генов в клетках S. erevisiae, освещены в предыдущих разделах данной главы. Здесь рассмотрим некоторые примеры продукции дрожжами экзогенных белков, имеющих важное значение для современной биотехнологии. [c.322]

Смотреть страницы где упоминается термин Экспрессия чужеродных генов в клетках: [c.145] [c.106] [c.123] [c.156] [c.366] [c.194] [c.315] [c.315] [c.351] [c.367] [c.384] [c.412] [c.206] [c.206] [c.214] [c.80] [c.121] [c.222] [c.262] [c.263] [c.265]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология