Фрагментирующие белки

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Последовательность нуклеотидов и генетический код. Методы определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны еще в 50-х гг. Теоретически это относительно легкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу элементарных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований-гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда еще в 60-х г. был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько разных нуклеотидных триплетов. Следовательно, суждения о нуклеотидной последовательности, основанные на последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того, последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодирующих участков ДНК. В настоящее время разработаны методы непосредственного секвенирования ДНК [117]. Принцип состоит в следующем длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющих ее в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очередность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающиеся концы идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности перекрывающихся фрагментов, образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно [c.131]

Исходный димер объединяемых генов состоит из генов 1 и 2, объединенных линкером, содержащим подходящие сайты рестрикции (/) димер фрагментируют ДНКазой I и образовавшиеся концы затупляют нуклеазой S1 (2) отбирают фрагменты, размер которых соответствует длине одного гена плюс длина линкера, (3) переводят их в кольцевую форму лигированием по тупым концам и 4) линеаризуют с помощью рестриктазы по сайту, который находится в линкере образующаяся в итоге библиотека генов содержит гибридные молекулы ДНК, кодирующие N-концевую часть белка 2 и С-концевую часть белка 1 (5) химерные гены клонируют в экспрессирующем векторе сразу или после амплификации с помощью ПЦР с использованием по одному из праймеров, комплементарных концам объединяемых генов, которые соседствуют с линкером, и после экспрессии химерных генов получают клонотеку химерных белков [c.330]

Фрагментирующие белки могут вызывать Са-зависнмое разжижение актиновых гелей [23, 33] [c.119]

Са -зависимые актин-фрагментирующие белки обнаружены почти во всех типах клеток позвоночных. Из них наиболее известны гельзолин, впервые вьщеленный из макрофагов, и виллии-один из главных белков микроворсинок эпителиальных клеток тонкого кишечника. Интересно, что эти белки, обладающие способностью соединяться сразу с несколькими свободными мономерами актина, могут служить мощными инициаторами полимеризации актша в растворе. Пока не ясно, какова главная функция этих белков в живой клетке укорочение актиновых филаментов или, наоборот, инициация их сборки. [c.119]

Рис 10-70. Фрагментирующие белки вызывают разрыв актиновых филаментов. Вероятно, это обусловлено их энергичным взаимодействием с глобулярными актиновыми субъединицами. Как правило, для этого необходимы ионы Са . Примерами такого рода белков могут служить вил-лин и гельзолин. [c.120]

Актин входит в состав многих клеточных структур и может связываться с целым рядом специфических белков. Жесткие пучки параллельно расположенных актиновых филаментов, скрепленных белковыми сшивками (например, фимбриновыми), имеются в микроворсинках и стереоцилиях, где они выполняют главным образом структурную роль. Пучки актиновых нитей, связанные с короткими биполярными агрегатами молекул немышечного. миозина, встречаются в определенных участках клетки, где нужна сократительная активность, например в сократимом кольце делящейся клетки, в опоясывающих десмосомах у апикальной поверхности эпителиальных клеток, а также в напряженных нитях, характерных для клеток, растущих в монослойной культуре. Менее упорядоченные системы актиновых филаментов содержатся во всей цитоплазме и могут придавать ей свойства геля. Густая сеть таких филаментов образует непосредственно под плазматической мембраной так называемый кортикальный слой. Эта сеть формируется с помощью гибких сшивающих белков, таких как филамин она способна обратимо изменять свои механические свойства в зависи.ности от концентрации ионов Са , что сопровождается повышением или понижение.ы вязкости цитоплазмы эти изменения происходят при участии актин-фрагментирующих белков, таких как гельзолин. Предполагается, что актиновые сети, прикрепленные с помощью специальных белков к плазматической мембране, взаимодействуют с немышечным миозином, обеспечивая подвижность клеточной поверхности, и играют ключевую роль в сложном процессе передвижения всей клетки. [c.120]

Белки цитоскелета по своим функциям могут быть подразделены на гелеобразуюш ие, фрагментирующие, кэпирующие (от англ [c.123]

Больщинство мембранных белков эритроцитов человека - это периферические мембранные белки, ассоциированные с бислоем на его плазматической стороне. Самый распрострапеппый из таких белков спектрин представляет собой длинную, тонкую, гибкую палочку длиной около 100 нм. Его масса составляет около 25% массы мембранных белков, что соответствует 2,5 х 10 копий на клетку. Спектрин является важным компонентом белковой сети (цитоскелета), поддерживающей структурную целостность и двояковогнутую форму эритроцитов (см. рис. 6-22). Если цитоскелет экстрагировать из теней эритроцитов растворами с низкой ионной силой, мембрана фрагментируется на мелкие пузырьки. [c.365]

Случайное объединение гомологичных мутантных фрагментов ДНК, в сумме составляющих всю структурную часть гена (DNA shuffling), с последующей экспрессией собранных таким путем генно-инженерных конструкций является еще одним распространенным и эффективным способом повышения разнообразия пула белковых молекул, используемых в направленной эволюции [85]. Реализацию этого подхода осуществляют в два этапа. Прежде всего, структурную часть гена в составе экспрессирующего вектора подвергают мутагенному воздействию, получая популяцию молекул ДНК, содержащих случайные мутации. Мутантные белки (следовательно, и кодирующие их гены) подвергают отбору на наличие в них определенных свойств (см. ниже). На втором этапе отобранные мутантные гены, которые кодируют требуемые белки, фрагментируют ДНКазой I и объединяют друг с другом in vitro с помощью ПЦР в отсутствие праймеров (рис. 43, а). Вместо инкубации с ДНКазой I для фрагментации генов также применяют ПЦР со случайным праймированием, осуществляемым короткими праймерами, которые обладают несколькими местами посадки в гене (рис. 43, б). [c.327]

Получение клонотек случайных последовательностей и их направленную эволюцию проводят в два этапа 1) исследуемую последовательность нуклеотидов подвергают случайному мутагенезу и отбору на основании свойств кодируемого этой последовательностью белка, 2) популяцию отобранных последовательностей фрагментируют случайным образом с помощью ДНКазы I а) или методом ПЦР с короткими случайно отжигающимися праймерами (б) и перекрывающиеся фрагменты объединяют друг с другом с помощью ПЦР без праймеров образовавшимися в итоге полноразмерными молекулами ДНК трансформируют компетентные клетки, среди которых проводят отбор по фенотипу на основании свойств исследуемого рекомбинантного белка [c.329]

Работа по созданию таких клонотек начинается с объединения двух генов в виде димера голова к хвосту , между которыми находится короткая линкерная последовательность, содержащая нужные сайты рестрикции (рис. 44, стадия 1). Димеры фрагментируют случайным образом, инкубируя их с ДНКазой I, образовавшиеся концы молекул затупляют нуклеазой S1, а сами фрагменты ДНК фракционируют по размерам, отбирая молекулы, длина которых соответствует размерам одного из исходных генов (стадия 2). Далее осуществляют внутримолекулярное лигирование этих фрагментов по тупым концам (стадия 3), что сопровождается образованием кольцевых молекул ДНК, которые далее линеаризуют с помощью рестриктаз по последовательности линкера (стадия 4). Итоговые гибридные молекулы ДНК кодируют N-концевую часть белка 2 и С-концевую часть белка 1, которые могут быть синтезированы в виде единой полипептидной цепи в результате экспрессии рекомбинантных генов после их клонирования в составе экспрессирующего плазмидного вектора. При этом, соотношение последовательностей двух объединяемых белков в составе гибридных молекул варьирует в широких пределах. [c.332]

Для стареющих клеток характерно ослабление синтетических и усиление гидролитических процессов. Наблюдается снижение содержания РНК и белков, возрастает активность гидролаз, пероксидазы, усиливается окисление липидов мембран, в органоидах и цитоплазме увеличивается количество липидных капель. Снижается полупроницаемость мембран и увеличивается потеря веществ клеткой. В органоидах и цитоплазме образуются автофагические вакуоли, набухает и фрагментируется ЭР. На последней стадии старения разрушаются хлорофилл и хлоропласты, диссоциируют ЭР и АГ, набухают митохондрии, в них снижается число крист, вакуолизируется ядро, разрушается ядрышко. Старение становится необратимым с момента разрушения тонопласта и выхода его содержимого (в том числе кислых гидролаз) в цитоплазму. [c.332]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология