Количественная оценка активности ферментов

Одним из активаторов амилазы, т. е. веществом, повышающим ее активность, является хлористый натрий (точнее, ион хлора), а одним из ингибиторов — ион меди. Для количественной оценки влияния активатора или ингибитора на амилазу определение активности фермента проводится в присутствии каждого из них в отдельности и результаты [c.115]

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, pH среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или Ц) за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин) . [c.157]

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ [c.32]

Очевидно, что энергия, которую фермент может израсходовать на ускорение реакции (т. е. на эффективное понижение активационного барьера), может иметь единственное происхождение — это часть свободной энергии, выделяемой при сорбции субстрата на ферменте. Предположение о накоплении тепловой энергии окружающей среды в ферменте и ее использовании в реакции означало бы вечный двигатель второго рода. Итак, энергия выделяется при сорбции субстрата. Была предложена гипотеза, согласно которой эта энергия трансформируется в энергию упругих колебаний глобулы, ведущей себя подобно капле жидкости. Частоты таких колебаний попадают в гиперзвуковую область — до 10" с . Стоячие волны в капле могут образовать пучность в области активного центра и энергия упругих колебаний может активировать молекулу субстрата. Количественные оценки, основанные на этой идее, показали, что энергия упругих колебаний глобулы действительно может достигать 20— 40 кДж/моль и обеспечивать значительное понижение эффективного активационного барьера. [c.193]

Кирквуд считал механизм флуктуационного взаимодействия фермента и субстрата универсальным и определяющим явление ферментативной активности в целом [97, 98, 100]. Все изложенное показывает, что за ферментативную активность ответствен ряд факторов, и здесь весьма важны конформацнонные явления. Теория Кирквуда не решает проблему. Вместе с тем и механизм Михаэлиса, и механизм Кирквуда отражают реальные свойства полиэлектролитной системы. Остается неясным, в какой мере, так как отсутствуют строгие количественные оценки и получить их трудно. [c.397]

Возможность создания полифункциональных ингибиторов с заданными жестко закрепленными расстояниями между реагирующими группировками придает им свойства химических шаблонов , при помощи которых можно решать многие задачи строения активной поверхности ферментов. Однако применение ингибиторов в качестве химических шаблонов требует строго количественной оценки их реакционноспособности по отношению к активным центрам. В связи с этим в последние годы в рамках ферментативной кинетики развиваются методы исследования кинетики ингибирования ферментов. [c.79]

При таком механизме процесса ингибирующее влияние продуктов реакции может рассматриваться как частный случай действия конкурентных обратимых ингибиторов. Следовательно, и количественная оценка ингибирующего действия продуктов реакции может быть дана на основе измерения константы диссоциации комплекса продукт — фермент (ее можно, по аналогии с константой ингибитора назвать константой продукта). Не исключено, однако, что продукт ферментативной реакции имеет возможность взаимодействовать, помимо того, с функциональными группами вне активного центра и, таким образом, влиять на активность фермента по принципу неконкурентного ингибитора. [c.99]

Активность фермента выражается в единицах ферментативного действия, что отражает количественные изменения, производимые ферментом в субстрате в определенный отрезок времени при строго определенных условиях - концентрации субстрата, pH, температуре и некоторых других условиях. Существует шкала для оценки степени обогащенности почв ферментами (табл. 25). [c.324]

Представляя для печати результаты, полученные при определении чистоты ферментного препарата с помощью гель-электрофореза, важно дать какую-то количественную оценку содержания всех присутствующих в нем примесей. Заявление, что образец дал одну полосу при электрофорезе , неубедительно, если количество нанесенного на гель белка было настолько мало, что получилась только одна слабо окрашенная зона. Желательно также представить какое-то подтверждение того, что окрашенная полоса — это действительно данный фермент, а не присутствующий в препарате другой белок, который в количественном отношении даже превосходит исследуемый фермент. В литературе часто встречаются примеры того, как совершенно ошибочно основная полоса, полученная при электрофорезе, без всяких доказательств приписывается очищенному ферменту, хотя на самом деле она относится к примеси. Если удельная активность выделенного препарата слишком низка, то количество данного фермента в нем может составлять всего лишь 1% общего содержания белка, и при гель-электрофорезе его вряд ли можно заметить. В этом случае могут помочь фотографии электрофореграмм, хотя на них обычно плохо воспроизводится картина распределения окраски по относительной интенсивности. Более надежные в этом смысле результаты дает сканирование окрашенного геля (рис. 9.7). При этом единственная оговорка, которую можно сделать, касается относительной интенсивности специфической окраски различных обнаруженных компонентов. Исходя из предположения, что все белки окрашиваются одинаково, можно произвести точное количественное определение всех компонентов, используя гель-сканирующее устройство. [c.329]

С задачей определения активности рестриктаз приходится сталкиваться в самых различных экспериментах в опытах по поиску продуцентов, изучению влияния условий культивирования на содержание целевых ферментов в биомассе, их очистке и характеристике каталитических свойств. Специфической чертой области энзимологии, посвященной изучению рестриктаз, является тот факт, что в подавляющем большинстве вышеуказанных опытов проводится в основном только качественная оценка активности исследуемых ферментов. Если в случае поиска продуцентов рестриктаз это является оправданным, то в ходе их очистки вынужденным. Последнее обстоятельство объясняется отсутствием простых количественных методов определения активности специфических эндонуклеаз. [c.126]

Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Последнее свойство обсуждаемого метода оказывается очень важным в тех случаях, когда в фракционируемой смеси содержится более чем одна рестриктаза. Кроме того, снижение интенсивности и четкости зон ДНК позволяет судить о наличии в фракциях неспецифических нуклеаз. Однако, электрофоретический метод наряду с отмеченными достоинствами имеет существенный недостаток, выражающийся в том, что количественное определение активности исследуемых ферментов проводится путем оценки перехода неполное расщепление—полное расщепление субстрата. Для того, чтобы идентифицировать этот переход, необходимо проводить обработку субстрата различными количествами фермента, что значительно увеличивает число анализируемых проб. Если учесть, что в ходе хроматографической очистки такой оценке подлежат многие десятки фракций, трудоемкость количественного определения активности рестриктаз электрофоретическим методом в таких опытах становится очевидной. Однако использование именно этого метода оправдывает себя в случае определения активности конечного препарата, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента. В этом случае необходимо знать количество фермента, обеспечивающее исчерпывающее специфическое фрагментирование [c.127]

При тщательной оценке источников погрешностей, свойственных цитохимическому подходу, можно отобрать те задачи функциональной нейрохимии, которые вполне наде/кно, с достаточной точностью могут быть решены средствами количественной цитохимии. Совершенствование же методического арсенала современной цитохимии позволяет рассчитывать на получение все более детальной информации о фракционном составе клеточных РНК и белков, активности отдельных ферментов и спектре их изоферментов, состоянии структур высшего порядка в исследуемых макромолекулах, метаболизме специфических клеточных белков нервной ткани и т. п. [c.151]

В настояш,ее время ингибиторный анализ ферментов является не только методом качественной идентификации функциональных групп, имеющ,их отношение к каталитической активности. Он находит все большее применение для количественной оценки реак-ционноспособности, выяснения особенностей строения активных центров. Появление в последние годы полифункциональных ингибиторов позволяет выявить взаимное расположение функциональных групп в активных центрах, т. е. подойти к расшифровке уникальной мозаики трехмерного строения ферментов, определяющей их субстратную специфичность. [c.79]

Методы оценки гидрогиназы — фермента, широко распространенного в бактериях, когда происходит восстановление СОг, серы, — зависят от используемых методов измерения активности гидрогиназы. Могут быть использованы метод восстановления окраски (метилен голубой или бензол виологен) изотопный обмен выделение молекулярного водорода. Однако интерпретация количественных результатов очень трудна. [c.101]

Подобная зависимость свидетельствует о том, что дезактивация изученных ферментов в однокомпонентных адсорбционных слоях связана с построением на поверхности неактивных четвертичных структур, тогда как изолированные ферментные глобулы как на липидных, так и на нелипидных поверхностях оказались достаточно активными. В качественной форме этот вывод не зависит от применимости или неприменимости изложенной теории. Теория необходима только для проведения экстраполяции к 6 = О, т. е. для количественной оценки степени воздействия поверхности адсорбента на третичную структуру ферментных глобул и для описания состава слоя при всех 6, что необходимо для суждения о четвертичной структуре белкового слоя. Поэтому изучение зависимости А ) от степени заполнения позволяет разделить эффекты, связанные с ролью в катализе третичной и четвертичной структуры белка. Неучет этого обстоятельства приводит иногда к неправильным выводам о неактивности адсорбированных ферментов или о разворачивании ферментной глобулы на поверхности раздела фаз. В большинстве адсорбционных систем неактивность фермента связана только с его высокой концентрацией в поверхностном слое, т. е. дезактивация связана с межбелковыми контактами в белковом слое, а не с влиянием поверхности носителей, природа которых в цитированных работах [4—15] изменялась в довольно широких пределах — от полярных и неполярных неорганических поверхностей (ЗЮз и С) до фосфолипидных слоев, аналогичных фосфолипидным мицеллам биомембран. [c.294]

Определение количества тепла, вьщеляемого культурой микроорганизма в единицу времени, СО2ИЛИ каких-либо специфических ферментов может служить основой количественной оценки антибиотической активности препарата. [c.177]

ВОЛЬНО часто, проблеме количественного анализа энзимограмм до сих пор уделялось сравнительно мало внимания. При этом нередко применяют методы, широко используемые для определения белков в зонах, окрашенных специфическими белковыми красителями. Энзимограммы сканируют с помощью денситометров и вычисляют площади пиков, которые служат мерой ферментативной активности. Другие методы количественной оценки ферментов- основаны на элюции и последующем определении ферментативной активности в растворе или на элюции окрашенного продукта, образовавшегося под действием фермента in situ. [c.282]

Наконец был предложен и опробован метод количественной оценки по стехиометрии взаимодействия. Теоретически невозможность установления надежной корреляции между количеством связанных первичных антител и связанного фермента в режиме a-ELISA (см. рис. 14-9) порождает сомнения в перспективности использования такого подхода. И все же метод можно использовать при наличии конъюгатов, стабильных н однородных по размеру, применение которых благодаря значи тельно меньшим пространственным затруднениям обеспечивало бы надежную количественную зависимость между активностью индикаторного фермента и числом связавшихся первичных антител (см. рис. 14-10). [c.238]

Длй количественной оценки эффективности С1ЮС0ба выделения субклеточных структур можно использовать метод, предложенный А. И. Арчаковым и соавторами (1973). Суть его заключается в следующем. Определив общую активность индикаторных ферментов мёмбран цитоплазматической сети в исходном гомогенате и полученном препарате (активность ферментов рассчитывают на общее количество белка гомогената или фракции), можно легко рассчитать выход микросомной фракции в процентах от содержания ее в гомогенате. Измеряя удельную активность индикаторных ферментов цитоплазматической сети (выделяемая структура) и загрязняющих препарат структур (митохондрий, лизосом, пероксисом) в гомогенате и изолированном препарате микросом, можно рассчитать степень очистки фракции по формуле [c.52]

Использование рационального редизайна полипептидных цепей рестриктаз E oRl и E oRV с целью изменения их субстратной специфичности пока не завершилось успехом [320]. Замены аминокислотных остатков, вовлеченных в процесс распознавания субстрата, неизменно сопровождались снижением специфичности фермента и уменьшением его удельной активности. Предполагается, что сложная сеть ДНК-белковых взаимодействий при взаимодействии рестриктазы с ДНК формируется кооперативно, и любые вмешательства в эту сеть приводят к отрицательным последствиям. В настоящее время остаются в значительной степени непонятными энергетические характеристики динамических структур, формирующихся в комплексах фермент-ДНК, а также, что еще более важно, нет возможности количественной оценки влияния каждого контакта в таких комплексах на все другие контакты, то есть на кооперативность взаимодействий. Кроме того, на сегодняшний день отсутствует понимание структурных и термодинамических особенностей, а также функциональной роли альтернативных конформаций ферментов, которые он принимает в комплексах с частично измененными сайтами рестрикции и которые не может расщеплять. Однако без таких знаний трудно рационально воздействовать на специфичность действия рестриктазы. [c.443]

Наиболее существенное следствие предложенной нами модели состоит в том, что понимание механизма окислительного фосфорилирования требует детального изучения реакций малого цикла, а не большого. Следует подчеркнуть, что в настоящее время количество экспериментальных работ по изучению кинетики АТФазной реакции необозримо (см. [56—60]), тогда как кинетике реакций, непосредственно связанных с синтезом АТФ, посвящены лишь единичные работы [74, 79, 80]. По-видимому, это связано, во-первых, с экспериментальными трудностями изучения кинетики окислительного фосфорилирования, а во-вторых, с тем, что необычные эффекты АДФ до самого последнего времени рассматривались как регуляторные. Последнее заслуживает краткого обсуждения. Появление аномального кинетического поведения ферментов в биохимии вообще и применительно к АТФазе в частности нередко связывают с особенностями ферментов как регулируемых катализаторов. Весьма часто, однако (и это справедливо в отношении функционирования АТФ-синтетазы митохондрий), в стороне от обсуждения остается вопрос что именно и для каких физиологических нужд регулируется аномальным немихаэлисовским поведением. Кроме явной несостоятельности общего утверждения о существовании регуляторных мест связывания для нуклеотидов в молекуле р1 слабой их стороной является отсутствие количественных оценок. Сродство р1 к АДФ при образовании медленного комплекса неактивной АТФазы чрезвычайно велико (К 10 — в отсутствие фосфата и /С 10- М — в присутствии физиологических концентраций фосфата). Это означает, что при реальных концентрациях АДФ в матриксе митохондрий специфическое для АДФ место связывания всегда насыщено нуклеотидом, и регулирование активности фермента внешним сигналом, реализующимся небольшими изменениями концентрации АДФ, неосуществимо. С другой стороны, так как основной функцией р1 является синтез АТФ, логично предположить, что постоянная насыщенность фер- [c.47]

В области препаративной биохимии рестриктаз практически, только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов. [c.163]

АОЙ ХИМИИ Количественная же оценка изменений при межмолекулярных взаимодействиях, т.е. конкретная реализация известных конформацион-цЬ1Х возможностей модифицированного пептида, требует как минимум знания структуры рецептора. О сложности возникшей здесь задачи убеди- пъио свидетельствует богатый опыт, накопленный за последние десятилетия энзимологией, где проблема идентификации лиганда и рецептора решается несравненно проще. При этом условии и даже при известной геометрии субстрата и активного центра фермента, а также знании чисто химических аспектов фермент-субстратных взаимодействий количественное описание каталитического акта как взаимообусловленного на всех своих стадиях и спонтанно протекающего процесса наталкивается на большие трудности и часто не может быть вьшолнено однозначным образом. [c.353]

Движение к активному центру есть движение конформона. Оно происходит путем конформационного раскрытия некоторой щели в глобуле, характеризуемой определенной микровязкостью. Структурное соответствие фермент — субстрат имеет динамический характер количественной мерой соответствия может служить критическая энергия деформации щели, соответствующей размеру и форме молекулы субстрата. При значении модуля Юнга е Ю эрг/см и длине краев щели 1 нм средняя амплитуда тепловых флуктуаций ширины щели составит 0,07 нм. Согласно этим оценкам скорость проникновения субстрата и образование ФСК составит 10 —10 с . Это не обязательно лимитирующая стадия ферментативного катализа. [c.198]

Как упоминалось выще, длину цепи полинуклеотида можно определить количественным определением концевых звеньев. В случае некоторых небольших полимеров гидролиз концевого фосфата (фосфатов) под действием очищенной фосфомоноэстеразы дает независимую оценку длины цепи из соотношения количества общего фосфора к количеству фосфора, выделенному в виде неорганического фосфата исследование оставшегося полинуклеотида уточняет природу концевых звеньев. Применение такого рода методов до некоторой степени ограничено высокой степенью чистоты, необходимой для применяемых ферментов, и изменением активности моноэстераз (и диэстераз) с изменением длины цепи полимера. Однако нуклеиновые кислоты второго и третьего типов все же были обнаружены (хотя и в гетерогенных смесях рибонуклеиновых кислот), причем нуклеиновые кислоты последнего типа, возможно, возникали главным образом в результате процессов расщепления [92]. [c.389]