Рибонуклеаза ионизация

Какие шесть групп рибонуклеазы подвергаются ионизации в интервале 2<рН<11,5 [c.124]

Рис. 32. Ионизация фенольных групп рибонуклеазы, измеренная с помощью поглощения ультрафиолетового излучения с длиной волны 295 ммк, при которой ионизированная форма имеет, как это видно на рис. 31, максимум поглощения. Кривые ионизации показывают, что три из шести фенольных групп диссоциируют гораздо легче, чем три другие .

Если конформационное изменение, сопровождающее процесс ионизации, обратимо, то такой же эффект наблюдается и при проведении обратного титрования. Часто, однако, возвращение к нативной конформации происходит очень медленно или даже оказывается невозможным. В таких случаях при обратном титровании остатки тирозина титруются нормально, так как отсутствует связь между процессом ионизации и конформационными изменениями. Более детальные экспериментальные данные приведены в гл. 7, где описано титрование остатков тирозина, входящих в состав рибонуклеазы, причем в данном случае специфическая ионизация этих остатков может наблюдаться оптическими методами. [c.51]

Самый ценный вывод, который был сделан на основании данных, полученных методом рентгеноструктурного анализа, состоит в том, что основной группой, отщепляющей протон от 2 -гидроксила, является Н1з-12, в то время как кислотная группа, отдающая протон уходящему 5 -кислороду, принадлежит Н1з-П9 [59]. (Любопытно, однако, что синтезированное производное рибонуклеазы с М -карбоксиметилированным остатком Н13-12 проявляет некоторую каталитическую активность — факт, в связи с которым возникает ряд вопросов [60].) Характер зависимости активности рибонуклеазы от pH согласуется с предложенным механизмом, поскольку найдены два значения р а (5,4 н 6,4), соответствующие двум группам, состояние ионизации которых контролирует активность фермента. (На основании ЯМР-спектров, показанных на рис. 2-42, было получено значение р/Са, равное 5,8.) Вблизи двух остатков гистидина расположен остаток Ьуз-41. Возможно, его положительный заряд используется для частичной нейтрализации отрицательного заряда на атомах кислорода фосфатной группы, облегчая атаку нуклеофильным агентом. С точки зрения химии рибонуклеазы интересен тот-факт, что под действием бактериальной пептидазы отщепляется фрагмент, содержащий двадцать аминокислотных остатков. Этот 5-пептид . Может воссоединяться с остальной частью молекулы с образованием активного фермента, называемого рибонуклеазой 5. Структура этого, фермента была определена методом дифракции рентгеновских лучей и по существу оказалась аналогичной структуре нативной рибонуклеазы. [c.121]

Использование уравнения Линдерштрема-Ланга [22] позволяет более детально обработать кривые титрования и получить некотор то добавочную информацию. На рис. И приведены полученные спектрофотометрически кривые титрования трех обратимо титруемых фенольных групп рибонуклеазы при трех ионных силах. По оси ординат отложена величина, стоящая в левой части уравнения (22) и равная рК+ДрК (а). Видно, что в соответствии с теоретическими результатами электростатическое взаимодействие обусловливает линейную зависимость поправочного члена к рК от степени ионизации а. Рассчитанная по уравнению (22) величина т оказывается равной 0,11, 0,09 и 0,06 при ионных силах 0,01, 0,03 и 0,15, что приближенно совпадает со значением, вычисленным по формуле (23), если принять радиус белковой глобулы 6=17 А, как должно быть для компактной структуры молекулы данного молекулярного веса. Это показывает, что в случае рибонуклеазы отсутствуют какие-либо особенности в титровании трех фенольных групп. Напомним, что, как уже отмечалось, три другие фенольные группы в молекуле рибонуклеазы не титруются вплоть до значений pH, приводящих к денатурации. [c.37]

Полученные результаты позволили сделать определенные выводы о трех группировках активного центра, значения р/С для которых составляли 5, 6 и 6, 7. На основании зависимости этих величин от температуры был сделан вывод, что наименьшее значение р/С относится к карбоксильной группе (слабая температурная зависимость), а наибольшее — к имидазольной группировке (сильная температурная зависимость). Природа группировки с промежуточным значением р/С, равным 6, оставалась (и остается до сих пор) неясной. Сама величина р/С 6 может быть отнесена к имидазолу, но вместе с тем она не зависит от температуры, что характерно для карбоксила. Авторы предполагают, что это имидазол с аномальной величиной АН ионизации, однако признают, что для окончательного доказательства этого предположения, нужны дополнительные данные. В этой работе были установлены детали механизма действия рибонуклеазы, в том числе обнаружены реакции изомеризации свободного фермента и комплекса фермент—продукт. Тшатель-ность кинетического анализа, проведенного в этой работе, позволяет отнестись с доверием к предложенному авторами химическому механизму действия рибонуклеазы, хотя не вполне ясно, действительно ли все обнаруженные реакции изомеризации входят в последовательность каталитических реакций. [c.218]

Денатурация белка в классическом смысле определялась как любая непротеолитическая модификация уникальной структуры нативного белка, приводящая к определенным изменениям химических, физических и биологических свойств [388]. Из этого определения исключаются изменения состояния ионизации, если только они не сопровождаются конформационными переходами. Денатурация может происходить в результате нагревания, изменения pH и добавления неполярных растворителей или некоторых специфических денатурирующих реагентов, например мочевины или солей гуанидина. Она также может быть вызвана восстановительным или окислительным разрывом дисульфидных связей, которые стабилизуют нативные конформации некоторых белков. Денатурация, как правило, сопровождается уменьшением растворимости белка. Это можно легко понять, так как гидрофобное взаимодействие, стабилизующее нативную конформацию, приводит к межмолекулярной агрегации, если полипептидные цепи принимают вытянутые конформации. Другим характерным последствием денатурации является раскрытие реакционноспособных групп, которые расположены внутри третичной структуры и становятся доступны воздействию реагентов при разрушении этой структуры. К числу наиболее пригодных методов наблюдения за процессами денатурации принадлежат спектроскопические измерения, измерения оптической активности и определение каталитической активности ферментов или биологической активности гормонов. Конформационные переходы при денатурации включают ряд процессов, которые в различной степени могут сказываться на каждом из наблюдаемых изменений, и поэтому понятие степени денатурации бессмысленно, если не будет установлен критерий, с помощью которого денатурация измеряется. Эта точка зрения иллюстрируется рис. 44, на котором изображено изменение оптической активности, поглощения света и ферментативной активности рибонуклеазы [389]. [c.136]

В результате свернутой формы макромолекулы часть групп, способных к ионизации, может оказаться блокированной на неполярных участках. При низких локальных значениях диэлектрической проницаемости в таких участках ионизация групп крайне затруднена. Этим можно объяснить тот факт, что часть фенольных групп в яичном альбумине [26 и ферментах — ианаине [27] и рибонуклеазе [22, 28] — не может быть ионизирована прежде, чем макромолекула примет вытянутую форму. [c.19]

Рибонуклеаза имеет мол. вес 13 680 и образована единственной полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных остатка [166, 167]. Связь между А1а-20 и 5ег-21 может расщепляться субтилизином. Интересно отметить, что при этом пептид остается связанным с остальной частью мо1екулы с помощью нековалентных связей. Модифицированный белок, названный рибонуклеазой 5, и нативный белок, называемый сейчас рибонуклеазой А, обладают одинаковой каталитической активностью. Благодаря своим небольшим размерам, простоте выделения и стабильности рибонуклеаза очень удобна для физических и химических исследований. Она была первым ферменгом, для которого удалось определить аминокислотную последовательность [166]. Кристаллическая структура обеих форм фермента была установлена с разрешением 2,0 А [168, 169]. Поскольку каталитическая активность рибонуклеазы зависит от состояния ионизации двух остатков гистидина, фермент всесторонне исследовался с помощью ЯМР — очень ценного метода для анализа свойств имидазольного кольца гистидина (гл. 5, разд. Ж-2.а). [c.388]

Химический механизм действия рибонуклеазы в том виде, в каком его себе сейчас представляют, был построен из общих соображений еще до установления кристаллической структуры фермента [170]. Известно, что график зависимости активности фермента от pH представляет собой колоколообразную кривую с максимумом при pH 7. рН-зависимостьйса1/ м показывает, что скорость гидролиза зависит от состояния ионизации в свободном ферменте основания с р/(а = 5,22 и кислоты с р/(а = 6,78, в то время как из рН-зависимости ft at следует, что в фермент-субстратном комплексе эти значения р/Са изменяются до 6,3 и 8,1. Было высказано предположение, что реакция катализируется по механизму общего кислотно-основного катализа с участием двух остатков гистидина, как выяснилось позднее,— His-12 и His-119 [c.389]