Слияние клеток вирусом Сендай

Клетки из селезенки мышей, предварительно иммунизированных антигеном, гибридизуют с клетками миеломной линии, растущей в культуре. Слияние индуцируют вирусом Сендай (о приготовлении вируса см. гл. 30). [c.402]

До недавнего времени мало было известно о локализации генов в хромосомах человека. Исключение составляли лишь признаки, сцепленные с полом (гл. 1, разд. В, 4), которые могут быть локализованы в Х-хромосомах. Ряд исследований, проведенных в последнее время, ознаменовались успехами и привели к систематическому картированию большого количества генов человека [169—171]. Наиболее важным оказался при этом метод слияния соматических клеток (дополнение 15-Д). Для слияния человеческих лимфоцитов с клетками грызунов часто используют инактивированный вирус Сендай, обладающий способностью вызывать сначала адгезию, а затем слияние клеток. Из гибридных клеток, полученных в результате слияния человеческих клеток с клетками мыши или хомяка, можно получить линии клеток, ядра в которых также сливаются. Хотя такие клетки могут размножаться, давая много поколений, тем не менее они склонны утрачивать при этом хромосомы, особенно те из них, которые ведут свое происхождение от клеток человека. Наблюдая за утратой определенных биохимических признаков, например некоторых ферментов, специфических для человека (которые могут быть отделены от ферментов хомяка методом электрофореза), можно установить наличие или отсутствие определенного гена в данной хромосоме. Очевидно, что для этого необходимо одновременно следить за потней хромосом на каждой стадии эксперимента. Новые методы окрашивания позволяют идентифицировать каждую из 26 пар хромосом человека. В настоящее время разрабатываются методы точного генетического картирования применительно к культуре клеток [171]. [c.268]

Образование гибридных клеток происходит гораздо чаше, если в культуру добавлены некоторые вешества, например полиэтиленгли-коль или инактивированные вирусы. Для этой цели часто используют вирус Сендай. У вирусов обычно имеются один и более специфических участков, благодаря которым они могут связываться с рецепторами клетки-хозяина. На поверхности вируса Сендай таких участков несколько. Таким образом, одна вирусная частица способна образовать мостик, соединившись сразу с двумя клетками. Вследствие очень малого размера вирусной частицы клетки окажутся чрезвычайно тесно сближены. При этом может произойти слияние плазматических мембран клеток и образоваться дикарион-клетка с двумя ядрами (рис. 18.4). Затем ядра [c.295]

Слияние клеток лучше проводить в суспензии, но можно-использовать и клеточные монослои. Действие вируса Сендай трудно контролировать, и процесс слияния клеток в монослое, выйдя из-под контроля, может приводить к образованию поли-кариот, содержащих до 10 ядер, большинство из которых оказываются нежизнеспособными. Для ограничения этого процесса рекомендуется брать сливаемые клетки в неравных количествах, например 1 1000. Монослой смешанных клеток следует проинкубировать в течение 24 ч, и затем, после удаления среды, обработать клетки инактивированным вирусом Сендай при О—4 С в течение 10 мин (за это время происходит адсорбция вируса), промыть несколько раз средой, не содержащей сыворотки, и инкубировать далее в ростовой среде при 37 °С. В этих условиях сливается примерно 4% клеток, но точное число слившихся клеток зависит главным образом от типа использованных клеток. При инкубации обработанных вирусом клеток при 37 °С клеточная мембрана, прилежащая к участкам адсорбции вируса, повреждается и образуются цитоплазматические мостики, соединяющие соседние клетки. Этот процесс происходит в тече- [c.191]

Известно, что при смешивании клеток они могут спонтанно сливаться, однако событие это чрезвычайно редкое [1]. Эффективность слияния может быть существенно увеличена с помощью специфических антигенов. Первоначально для этой цели использовали инактивированный вирус Сендай [32], однако биологическая неоднородность различных партий инактивированного вируса и громоздкость процедуры слияния, индуцированного вирусом, привели к широкому использованию химического индуктора —полиэтиленгликоля (ПЭГ) [33]. Метод, представленный ниже, пригоден для слияния клеток как одного, так и разных видов животных. Внутривидовые гибриды формируются с частотой 10- —10- . Частота слияния клеток разных видов варьирует от 10 до 10 Клетки, имеющие сходные фенотипы и близкие параметры роста, сливаются с более высокой частотой. [c.13]

Весьма эффективным инструментом в изучении рецепторов является метод слияния разных клеток. Это достигается либо с помощью вируса Сендая 7 либо с помощью химических агентов (например, полиэтилен-гликоля), вызывающих слияние плазматических мембран разных клеток с образованием одной клетки из нескольких. [c.141]

Вторым этапом заражения является слияние оболочки вириона с клеточной мембраной. У парамиксовирусов этот процесс осуществляется другим гликопротеином F. Форма-предшественник Fo вне клетки подвергается протеолитическому расщеплению на большую субъединицу Fi, которая содержит новый гидрофобный N-конец (рис. 24.14), проникающий в клеточную мембрану, и меньшую нефункциональную субъединицу Рг, связанную с Fi дисульфидным мостиком [57]. Все изложенное указывает на эволюционную связь между парамиксовирусами и вирусом гриппа. На этом, впрочем, аналогия между ними кончается. Вирионы вируса гриппа попадают в клетку в составе эндосом — внутриклеточных везикул с низким значением pH, изменяющим конформацию НА и облегчающим внедрение субъединицы НА2 в мембрану везикулы. При нейтральных значениях pH, характерных для межклеточного пространства, слияния с мембраной не происходит. Что касается вируса Сендай с расщепленным F-белком, то он осуществляет слияние мембран даже в таких условиях и именно поэтому часто используется как агент, стимулирующий слияние клеток, при получении клеточных гибридов [26]. Таким образом, вирус Сендай и другие парамиксовирусы проникают в клетку непосредственно через клеточную мембрану, без посред- [c.474]

Слияние клеток вирусом Сендай в суспензии 1) клетки А и Б культивируют в монослое, обрабатывают трипсином и снимают с культуральных флаконов средой, содержащей 10 % сыворотки (присутствие сыворотки необходимо для предотвращения образования клеточных комков при снятии) 2) клетки А и Б по отдельности центрифугируют 5 мин при 700 g, сливают супернатанты, ресуспензируют в 1 —10 мл (в зависимости от массы осадка) раствора Хэнкса, подсчитывают количество клеток в камере Горяева 3) смешивают клетки А и Б если клетки имеют одинаковые размеры и одинаковую способность к прикреплению, то их численное соотношение должно быть примерно равно 1 в остальных случаях следует брать избыток более мелких и хуже прикрепляющихся клеток (см. метод 1.3, п. 5) доводят объем смешанной суспензии клеток до 50—100 мл раствором Хэнкса, центрифугируют 5 мин при 4 °С и 700 g 4) сливают супернатант, ресуспензируют клетки в холодном растворе, содержащем инактивированный вирус Сендай (содержание клеток в жидкости должно составлять 2—5 млн./мл), переносят суспензию в пробирку емкостью 10 мл, инкубируют 30 мин при 4 °С 5) добавляют в пробирку нагретую до 37 °С культуральную среду без сыворотки в объеме, равном объему суспензии клеток, переносят пробирку в водяную баню и инкубируют 45 мин при 37 °С 6) переносят суспензию в пробирку емкостью 100 мл, разводят в 10 раз теплым раствором Хэнкса, центрифугируют 5 мин при 700 g и комнатной температуре [c.182]

На следующем этапе смешивают примерно 10 миеломных клеток с 10 клеток селезенки. Клетки в среде без сыворотки выдерживают 45 мин., центрифугируют в конических пробирках. Супернатант удаляют, осадок встряхивают и к нему добавляют 2 мл. 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ММ примерно 1,5—4,0 кДа, померживают температуру 37°С, pH среды 7,6—7,8, выдерживают 30 мин., затем в течение последних 7—8 мин. добавляют среду Дальбекко с фетальной телячьей сывороткой (5—15%). Клетки в разведенном ПЭГ осаждают, ресуспендируют в 30 мл. гибридомной среды с сывороткой и распределяют в лунки объемом 2 мл для микротитрования. При необходимости среду заменяют на свежую (среда с гипоксантином и тимидином). В среду добавляют клетки-фидеры, или "кормилки" (от англ. feeder — приток, питатель) — преимущественно перитонеальные макрофаги, индуцированные минеральными маслами) и 1% карбоксиметилцеллюлозу. В качестве индукторов слияния клеток можно использовать вирус Сендай, температурный шок, электроразряд и др. [c.574]

В последнее время в области изучения трансформированных клеток было обнаружено интересное яв.че-ние. Оказалось, что слияние клеток различных видов (гетерокариот), вызываемое парамиксовирусами (например, вирусом Сендай см. гл. VII, разд. К), приводит к появлению в трансформированных клетках инфекционных вирусов [538]. [c.269]

Осуществить слияние клеток и получить внутри- или межвидовые гибриды клеток млекопитающих методически проще, чем в случае микроорганизмов или растений, так как клетки млекопитающих не имеют клеточной стенки, которую необходимо удалять перед слиянием. Первый метод контролируемого слияния клеток млекопитающих был основан на использовании инактивированного вируса Сендай. Этот вирус относится к группе парамиксовирусов его вирион покрыт липидсодержащей оболочкой, сливающейся с мембраной клетки-хозяина и обеспечивающей проникновение вируса в клетку. Вирус способствует слиянию, связываясь одновременно с мембранами двух клеток. В опытах по слиянию клеток млекопитающих используются также некоторые химические вещества (ионы кальция, лизоле-цитин, ПЭГ). [c.312]

Между прочим, сейчас электрический пробой мембраны используют для слияния между собой разнородных клеток. Создание таких гибридных клеток позволяет решать разные задачи цитологии, генетикч и даже биотехнологии. Сами по себе клетки не сд п-ваются. Раньше основным инструментом для слияния клеток был специальный вирус — вирус сендай, сейчас с той же целью начали использова1Ь (в частности, в Институю электрохимии АН СССР) электрический пробой, [c.146]

Рис. 18.5. Получение гибридной клеточной линии человек-грызун. Человеческие клетки, в данном случае лейкоциты, смешиваются с клетками выбранной линии грызуна в присутствии вируса Сендай. Сначала формируются клетки с двумя ядрами, дикарионы. При слиянии ядер образуются одноядерные гибридные клетки, синкарионы. Если клетки переносятся на селективную среду, то вырастают только гибридные линии. Например, если реципиентная линия клеток грызуна несет ауксотрофность по глицину, используют селективную среду, не содержащую этой аминокислоты. Неслившиеся лейкоциты человека также неспособны пролиферировать в культуре клеток. Каждая выросшая колония клеток содержит полный геном реципиентной клеточной линии грызуна и несколько донорских хромосом человека.

Наиболее высококонсервативная последовательность в НА разных штаммов расположена на неполярном N-конце НА2, ассоциированном с активностью, благодаря которой вирус проникает в мембрану хозяйской клетки, инициируя инфекцию. Расщепление НА на НА1 и НА2 необходимо для инфекционного проникновения и слияния in vitro i[106, 124, 149] оно происходит в результате значительного изменения конформации НА [261]. Гомологичная расположенной на N-конце НА2 последовательность присутствует в. сайте активации кливеджа — сайте белка слияния (F-fusion) вируса Сендай [82, 213, 234, 235, 236]. На важность этой аминокислотной последовательности для процесса слияния указывают данные, что синтетические пептиды, имитирующие соответствующую последовательность либо N-конца НА2, либо N-конца белка F вируса Сендай, ингибируют процесс проникновения вируса [213]. Однако трудно объяснить, каким образом N-конец НА2 непосредственно вовлечен в процесс проникновения в клетку, поскольку он локализован в 10 нм от отдаленной верхушки молекулы НА и в. [c.48]

Харрис и Воткинс (1965) [254] повысили частоту слияния различных клеток путем воздействия вирусом Сендай, предварительно инактивированным ультрафиолетом. С помощью этого метода им удалось показать, что слиться могут клетки самых разных видов организмов и что слившиеся клетки жизнеспособны. С этой работы началось широкое использование метода гибридизации клеток в различных областях клеточной биологии. [c.200]

Используя вирус Сендай, удалось осуществить слияние клеток абсолютно разных видов организмов и тканей. В качестве родительских брали самые разные клетки животных, человека и бактерий. При слиянии клеток разных видов животных были получены межвидовые гибриды клеток мыщи и человека (рис. 67), крысы и человека, человека и китайского хомячка, человека и курицы, человека и москита, крысы и мыши, мула и мыши и др. Оказалось возможным также гибридизировать клетки разных тканей, например лимфоцита и фибропласта, или нормальные клетки с опухолевыми. Такие межвидовые гибридные клетки оказываются жизнеспособными и часто размножаются в течение длительного времени. [c.168]

В 1975 г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомно14 технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены. В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линие11 миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай [1]. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль (ПЭГ) [2 ]. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы in vitro за несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена [3]. Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах [4-7 ]. [c.37]

Для стимуляции слияния липосом с клетками можно использовать либо белки вируса Сендай, либо полиэтиленгликоль. Белки вируса Сендай включаются в состав липосом в процессе реассоциации при этом слияние с клетками в определенных условиях происходит спонтанно (Vainstein et al., 1983). Можно также добавлять вирус Сендай во внешнюю среду. Содержащие фосфатидилэтаноламин липосомы имеют тенденцию к спонтанному слиянию с лимфоидными клетками ( orrea-Freire et al., 1984). [c.158]

Наконец, многочисленные исследования показали, что обработка интерфероном индуцирует изменения в плазматической мембране клеток. Доказательства этого утверждения сводятся к следующему. Во-первых, предварительная обработка L-клеток мышиным интерфероном подавляет проникновение VSV в клетки, не влияя на адсорбцию [266]. Во-вторых, и а-ИФН, и -ИФН подавляют слияние клеток, вызываемое вирусом Сендай [37, 242] и вирусом саркомы мышей Молони [3], вероятно, за счет увеличения жесткости мембраны. В-третьих VSV, который в небольших количествах выходит из клеток, обработанных интерфероном, дефицитен по белку М и гликопротеину поверхностных выступов G [115]. Это свидетельствует о подавлении сборки вируса. В-четвертых, подавление размножения ретровирусов в клетках, обработанных интерфероном, вероятно, обусловлено его влиянием на плазматическую мембрану (см. ниже). [c.64]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология