Линии миеломных клеток

В ряде случаев для определения частоты соматического мутагенеза необходимо исследовать огромное число клеток, экспрессирующих один и тот же V-ren. Практический подход для идентификации такой группы состоит в характеристике иммуноглобулинов, получаемых от серии клеточных линий, осуществляющих иммунный ответ на одинаковый антиген. (Используемые для этой цели антигены представляют собой маленькие молекулы, имеющие дискретную структуру, которая, по-видимому, обусловливает стойкий иммунный ответ. Они отличаются от больших белков, отдельные части которых могут стимулировать образование разных антител. Эти маленькие молекулы получили название гаптенов. Для того чтобы придать им свойства антигена, их соединяют с инертным белковым носителем. Иммунизируя таким антигеном мышь, получают реактивные лимфоциты, которые соединяют путем слияния с миеломными клетками для получения гибридом. Такие гибридные клетки продолжают независимый синтез желаемого антитела.) [c.515]

Иммунизация крыс проводится в тех случаях, когда требуется получить антитела к антигенам мыши, для которых отсутствует полиморфизм у разных линий мышей. Полученные гибридом-ные клетки можно выращивать в организме крыс, если применять миеломные клетки крыс, или в организме мышей после подавления их иммунологической реактивности (см. ниже). [c.100]

Подготовка миеломных клеток. При выборе миеломных клеток следует основываться на данных табл. 8. Необходимо учесть, что клеточные линии изменяются и иногда их способность к слиянию падает или же синтез антител гибридными линиями становится нестабильным. Поэтому лучше иметь не одну какую-то линию клеток, а по крайней мере три. Первые опыты по слиянию нужно провести со всеми линиями, и клетки, которые дали наилучшие результаты, заморозить в достаточном количестве. [c.104]

Клетки из селезенки мышей, предварительно иммунизированных антигеном, гибридизуют с клетками миеломной линии, растущей в культуре. Слияние индуцируют вирусом Сендай (о приготовлении вируса см. гл. 30). [c.402]

Следовательно, для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, - моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимого типа — расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая спо- [c.184]

В развитых странах каждый пятый человек умирает от рака, но вряд ли стоило бы только по этой причине посвящать ему здесь целую главу. Первое место по количеству вызываемых смертей занимают все-таки сердечно-сосудистые заболевания, да и многие другие болезни причиняют людям ничуть не меныпе вреда. Очень серьезную проблему для человечества представляют несбалансированное питание и инфекционные болезни. Важность изучения клеточной биологии рака в значительной мере обусловлена тем, что в основе родственных заболеваний, объединенных под этим названием, лежат нарушения наиболее фундаментальных законов поведения клеток в многоклеточном организме. Для того чтобы разобраться в сущности рака и разработать рациональные способы его лечения, необходимо понять как внутренние механизмы жизнедеятельности клеток, так и механизмы взаимодействия их друг с другом в тканях и организме в целом. Именно по этой причине фундаментальные исследования рака столь существенно обогатили наши знания о нормальных клетках. Ведь в ходе этих исследований были созданы эффективные методы, которые во многом определяли нынешнюю революцию в клеточной биологии. Достаточно назвать использование обратной транскриптазы из онкогенных РПК-содержащих вирусов и линий миеломных клеток (потомков раковых В-лимфоцитов) для получения соответственно кДПК (разд. 4.6.3) и моноклональных антител. Можно спорить о том, в какой степени огромные средства, брошенные на лабораторные исследования в этой области, способствовали выполнению основной задачи - развитию терапии рака, однако не подлежит сомнению, что стимулированный ими прогресс клеточной биологии значительно углубил наши знания в областях медицины, выходящих за пределы чистой онкологии. [c.445]

Выбор экспериментального животного. Он определяется наличием родительских миеломных линий, возможностью получения гибридов клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также способностью к размножению полученных гибридом в организме животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс щироко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных. При иммунизации мышей берут линию Ва1Ь/С это связана с тем, что все имеющиеся миеломные линии, образую- [c.99]

Авторы отобрали линию миеломных клеток (РЗ-Х63 Ag 8), устойчивых к 8-азагуанину благодаря отсутствию у них фермента, способного вести синтез АМФ за счет прямого присоединения рибозофосфата к гипоксантину или гуанину. Этот фермент обеспечивает запасной путь синтеза АМФ в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций такого синтеза заблокирована, например присутствием ингибитора аминоптери-на. На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминопте-рин и тимидин (НАТ-среда), эти миеломные клетки не размножаются. [c.113]

В каждой из отобранных таким образом лунок еще содержалось около 200 ООО клеток. В силу полиспецифичности иммунного ответа (см. выше) они еще не были моноклональны, поэтому далее клетки из этих лунок рассеивали ло одной, выращивали колонии и снова их сканировали, т. е. производили обычные операции клонирования, позволяющие в конце концов отобрать наилучший по заданным параметрам клон гибридом, образующих совершенно одинаковые <смоноклональные> антитела. Моноклональные гибридомы в суспензии вырабатывают 5—10 мкг антител на 1 мл среды. Однако полученные от чистых линий BALB гибридомы сохраняют присущую миеломным клеткам способность к опухолевому росту. Ими инокулируют мышей и после нескольких пассажей получают в асцитной жидкости моноклональные антитела в огромном количестве — до 50 мг чистых антител на мышь (титр 10 10 ). [c.115]

Животных (обычно мышей или крыс) иммунизируют антигеном. Когда продукция антител достигает высокого уровня, из селезенки животных (могут быть использованы и лимфоузлы) готовят суспензию клеток. Затем вызывают слияние спленоцитов с клетками ми-еломной линии, применяя для этой цели полизтиленг-ликоль (ПЭГ) — агент, способствующий слиянию клеточных мембран. Процесс проходит успешно лишь у небольшого числа клеток. Клеточную смесь, содержащую слившиеся клетки, культивируют в ГАТ - среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин является высокотоксичным агентом, блокирующим один из метаболических путей - синтез пуринов. Клетки могут использовать обходный метаболический путь, если в среде присутствуют его интермедиаты - гипоксантин и тимидин. Спленоциты способны расти в ГАТ-среде, однако миеломные клетки в ней погибают, так как имеют метаболический дефект. не позволяющий использовать обходный путь синтеза пуринов. Клеточная суспензия, вносимая в ГАТ-среду, содержит спленоциты, клетки миеломы и слившиеся клетки. Спленоциты погибают в культуре естественным путем через 1-2 нед, клетки миеломы не выживают в ГАТ, слившиеся же клетки сохраняют жизнеспособность, поскольку сочетают свойства бессмертной миеломы и клеток селезенки, использующих обходный метаболический путь. Некоторые из слившихся клеток сохраняют также способность про- [c.537]

Партнерами для гибридизации являются клетки селезенки предварительно иммунизированной мыши и клетки культивируемой мышиной миеломной линии Зрг/О—Agl4 или X63-Ag8.6.5.3., резистентные к 8-азагуанину. [c.311]

Образование и отбор гибридных клеток Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам антигена. После ряда иммунизаций, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие В-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (НОРКТ ). Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-НОМ полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ). [c.185]

Изучение аминокислотных носледовательностей миеломных белков привело к предположению о том, что вариабельная (V) и константная (С) области каждой из ценей Ig могут кодироваться двумя отдельными генными сегментами, которые каким-то образом соединяются в ДНК перед их экспрессией Первые прямые данные о перестройке ДНК в процессе развития В-клеток были получены в 1976 г. при сравиеиии ДНК из раииих мышиных эмбрионов, неснособных к выработке антител, с ДНК из клеток мышиной миеломной клеточной линии, вырабатывающих антитела. Как показали эксперименты, специфические носледовательности, кодирующие V- и С-области и исиользуемые клетками миеломы. находились в этих клетках в одном и том же рестрикционном фрагменте, а у эмбрионов - в двух разных рестрикционных фрагментах. Следовательно, на каком-то этане дифференцировки В-клеток происходит перестройка последовательностей ДНК, кодирующих молекулы антител (рис. 18-30). [c.244]

Линии клеток, продуцирующих моноклональные антитела, обычно получают от грызунов, например мышей и крыс, дающих хороший иммунный ответ на иммуноген. Готовят суспензию клеток селезенки этих животных и вызывают их слияние с мие-ломными клетками. Полученные в результате слияния клетки обладают свойствами и тех, и других родительских клеток, сочетая в себе способность к неограниченному размножению, свой-ствеипую миеломным родительским клеткам, со способностью продуцировать специфические антитела, присущей В-лимфоци-там селезенки. Выделение клона клеток, продуцирующих одно антитело, позволяет нарабатывать эти моноклональные антитела в больших количествах. [c.180]

В этих экспериментах была использована так называемая попусел ктивная система ГАТ когда только одна родительская линия, а именно м слома РЗ ХЬЗ Ар 8, была химически маркирована Селекция ги ридов основана на том. что в ГАТ среде родительские миеломные ктетки погибают, а нор шльные клетки [c.94]

Гибридомы человека секретируют очень низкий уровень антител (50 НГ — 10 мкг/мл) в основном IgM класса. Это может быть связано с особенностями родительских миеломных линий человека, выбранных для слияния. Имеющиеся в настоящее время линии человека не являются истинными плазматическими клетками, как в случае миелом мыши, а принадлежат скорее всего к менее дифференцированным лимфобластоидным клеткам. [c.120]

Гкбридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния антителопродуцирующей клетки с миеломной, активно пролиферирующей клеткой, у которой отсутствует собственный синтез иммуноглобулинов гибридома образует высокоаффинные антитела узкой специфичности. [c.460]

Гибридные клетки (гибридомы) отбирали по их способности размножаться на НАТ-среде. Присущая клеткам миеломы способность к быстрой пролиферации в этом случае восстанавливалась за счет привнесения клетками селезенки упомянутого фермента запасного пути синтеза АМФ. Этот этап селекции гибридных клеток играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации. Достоверность получения гибридом была подтверждена не только фактом их пролиферации на селективной среде, но и прямым анализом кариотипа этих клеток было обнаружено почти суммарное число хромосом родителей . Методом гемолиза было показано, что эти гибридомы образуют антитела к эритроцитам барана. Более того, путем селекции удалось отобрать такие штаммы гибридом, которые выделяли в питательную среду только эти селезеночные антитела и не синтезировали иммуноглобулинов миеломного происхождения. Использовав изначально мышей линии BALB, авторы смогли путем инъекции отобранных таким образом гибридом мышам этой же линии стимулировать развитие у них злокачественных новообразований, ведущих массированный синтез антител к эритроцитам барана. [c.113]

Эффективно продуцировать моноклональные антитела могут любые В-клетки, необходимо лишь сделать их для этого бессмертными и пролиферирующими. Чаще всего для этой цели получают гибридные клетки — путем слияния мышиных спленоцитов с миеломными В-клетками от мышей той же линии, не секретирующими собственных антител. Возможно также получить межлинейные или межвидовые гибриды, однако они часто нестабильны. Другой метод имморта-лизации — это трансформация клеток, например в случае В-клеток человека путем инфицирования вирусом Эпштейна—Барр. [c.537]

Подготовка миеломных клеток. В гибридомной технологии используют различные миеломные линии (см. обзор [Ю]). Все они имеют генетические маркеры, позволяющие работать с ними в селективных условиях. Наиболее распространены в настоящее время две линии — 5р 2/0 Agl4 и Х63Ад8 6.5.3. Эти клеточные линии имеются во Всесоюзной коллекции клеточных культур. Обе они являются цроизводными линии РЗК, полученной из миеломы мышей ВАЬВ/с МОРС-21. Преимуществом этих клеток является вторичная утрата ими способности синтезировать собственные иммуноглобулины. Клетки дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансфераза, благодаря чему устойчивы к 8-азагуанину и чувствительны к среде ГАТ (см. ниже). Реверсии в этих клетках являются чрезвычайно редким событием, тем не менее рекомендуют каждые 3—б мес эти клетки культивировать в течение 2—3 пассажей на среде с 8-азагуанином (2- 10 М). [c.196]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология