Цитофотометрия

Настоящая книга, издаваемая в серии научных трудов ВИР, освещает методы и методики по определению содержания нуклеиновых кислот в растительных тканях и препаратах. В ней также изложены — идентификация и количественный учет свободных нуклеотидов выделение нативных РНК и ДНК из растений фракционирование их на колонках определение нуклеотидного состава РНК и ДНК методами колоночной и бумажной хроматографии изучение свойств макромолекул нуклеиновых кислот, обнаружение их в клетке, цитофотометрия, определение состояния ДНК и РНК в клетке. [c.2]

Количественная оценка цитохимических реакций производится с помощью методов микрохимического анализа [4] и цитофотометрии. Последняя является обязательным элементом современных цитохимических исследований. Более детально теория и техника цитофотометрии рассмотрена в книге В. Я. Бродского [2]. [c.130]

Общие принципы цитофотометрии [c.130]

Сущность цитофотометрии заключается в определении оптической плотности исследуемого участка препарата, обусловленной наличием вещества или окрашенного комплекса. При этом определяется интенсивность света (/), прошедшего через исследуемый участок клетки в показаниях гальванометра, затем интенсивность света (/о), прошедшего через такую же площадь поля препарата, но не занятого тканью или изучаемой структурой. [c.131]

Наиболее надежным методом цитофотометрии НК является цитофотометрия в УФ. Этот метод основан на способности НК интенсивно поглощать УФ свет в узкой зоне спектра, в пределах 255—265 ммк. [c.132]

Методы цитофотометрии НК в УФ описаны в целом ряде оригинальных работ и специальных руководствах [2], [3], [5], [9]. Существуют два варианта этого метода — фотографический и фотоэлектрический. Первый более доступен, так как не требует сложного и дорогостоящего оборудования, но очень громоздкий. Второй более удобен. При этом точность измерений фотографическим и фотоэлектрическим способами примерно одинакова — ощибка определения в том и другом случае находится в пределах 5—10%. [c.132]

Колориметрические определения обычно выполняют в растворах объемом 10 жл и больше. В микроанализе для одного колориметрического определения требуется 1 мл и больше анализируемого раствора. К области ультрамикроанализа следует отнести такие колориметрические методы, которые дают возможность работать с 50 мкл и со значителЁно меньшими количествами растворов. При колориметрическом анализе клеток или их частей объемы анализируемых объектов значительно меньше 1 мкл. В них удается определять до 10 мкг вещества 44]. Ультрамикрометоды, основанные иа измерении иоглощения света и применяемые для исследования отдельных клеток или их частей, достаточно широко распространены и носят название цитофотометрии [96], [c.150]

В методическом отношении цитофотометрия НК растений встречает ряд Трудностей. В растительных клетках и особенно в клетках дифференцированных тканей содержится ряд веществ, которые поглощают УФ в той же зоне, что и НК- К таким веществам относятся различные пигменты, дубильные вещества и ряд производных лигнина. В эмбриональных клетках серьезные помехи создает аскорбиновая кислота, максимум поглощения которой приходится на 265 ммк. Аскорбиновая кислота, как и НК, имеет высокий коэффициент экстинкции. [c.132]

Присутствие этих соединений в клетке вносит ряд осложнений в цитофотометрию НК и требует постоянной проверки результатов цитохимических исследований. Такая проверка, где [c.132]

При количественных определениях методом цитофотометрии необходимо учитывать также следующие обстоятельства. Во-первых, изменение молярной экстинкции НК в зависимости от их физико-химического состояния. Как известно, нативные НК в сравнении с денатурированными имеют сравнительно низкий коэффициент молярной экстинкции. В то же время степень денатурации НК в микроскопических препаратах учесть практически невозможно. [c.133]

Б р о д с к и й В. Я. Цитофотометрия в видимой и ультрафиолетовой области спектра. Руководство по цитологии, т. 1. Наука , 1965. [c.139]

Для раздельной количественной цитофотометрии НК применяется избирательное экстрагирование ДНК или РНК. Для определения ДНК А. Дейч рекомендует удалять РНК гидролизом препарата 1 н. НС1 при 60° в течение 6—10 минут. [c.159]

Первый способ — сканирование (развертка) объекта с интегрированием величин поглощения в каждой точке. При достаточно малом диаметре светового пучка распределение вещества в сечении светового потока молено считать гомогенным, поэтому интегрирование по всей длине сканирования обеспечивает суммарное определение количества вещества в клетке с весьма большой точностью. Критический разбор этого способа цитофотометрии, его технические варианты и возможности автоматизации для анализа целых клеточных популяций описаны в работах Агроскина и др. (1967, 1970) и Хруста и др. (1971). [c.142]

IV. Перед цитофотометрией летки должны быть освобождены от этанола центрифугированием и ресуспендированы в фосфатном буфере или другом реагенте. [c.201]

Наиболее разработанными методами количественной цитохимии НК к настоящему времени являются методы цитофотометрии, основанные на изм ерении поглощения света веществами клетки или продуктами гистохимических реакций. [c.130]

Цнтостатики 1/64 2/1156 4/220 Цитотоксичные вещества 4/1195 Цитофотометрия 5/769 Цитохимия 5/769, 770 Цитохром-с-оксидаза 5/770, 771, 772, 1054 1/558 2/241, 242, 968 3/50, 51, 517, 670 Цитохром-Ьз-редуктаза 3/50 Цитохромы 5/772, 34, 109, 345, 346, 770,771,773 1 /470,472,475 2/241, 968 3/36, 50, 51, 503, 622, 669, 670, 697 4/144, 524, 541,861 Цитраконовая и мезаконовая кислоты 5/773 3/570 [c.752]

Для создания STS были разработаны различные подходы. В одном из них ДНК из очищенного препарата одной хромосомы человека, изолированной при помощи проточной цитофотометрии, обрабатывают рестриктазой и клонируют в векторе, способном акцептировать небольшие (<1000 п. н.) фрагменты ДНК. Затем секвенируют вставки из клонов, выбранных случайным образом, и отбрасывают те клоны, в которых вставки короче 100 п. н., и те, которые содержат последовательности из повторяющихся элементов ДНК человека. Наличие повторов определяют при помощи компьютерных программ, сравнивая нуклеотидную последовательность вставки с последовательностями всех известных повторов ДНК человека. Затем для каждого отобранного клона находят нуклеотидные последовательности праймеров. Каждый STS тестируют на предмет уникальности амплифицируемого фрагмента хромосомной ДНК. [c.463]

Цитохимические исследования НК проводятся на микроскопических препаратах с помощью обычных или специальных микроскопов и оптических приборов — цитофотометров. Основ-ной смысл цитохимических исследований НК заключается в конечном счете в выяснении трех главных вопросов 1) локализация НК в клетке 2) содержание НК в клетке и отдельных клеточных структурах 3) состояние молекул НК в клетке, т. е. характер связи с другими химическими компонентами клетки и молекулярная организация их в клеточных структурах. [c.127]

В общем виде принципы цитофотометрии те же, что и для фотометрии. По закону Ламбердта-Бера, поглощение света, выраженное логарифмом величины, обратной пропусканию (Е), [c.130]

В клетках с низким относительным содержанием НК цитофотометрии их Б УФ мещают белки. Последние имеют максимум поглощения при 280 ммк. Их молярная экстинкция при 260 ммк во много раз меньше, чем у НК. Однако в клетках, богатых белками и бедных НК, например в дифференцированных тканях, в семядолях и эндосперме семян, цитофотометрия НК в УФ иногда невозможна, так как в зоне поглощения последних вместо пика нередко образуется седловина . В этом случае целесообразна цитофотометрия специфических реакций на НК в видимом свете (реакция Фельгена, окраска галлоциа-нин-хромовыми квасцами). [c.133]

Во-вторых, потери лабильно связанных в клетки фракций НК. В процессе приготовления препарата, а также во время процедур, связанных с получением той или иной реакции на НК, возможно вымывание из клетки значительной части т-РНК, части р-РНК, а также лабильной ДНК. В некоторых случаях эти потери могут быть весьма существенными. Это обстоятельство должно всегда настораживать исследователя не только при ци-тофотометрии в УФ, но и при цитофотометрии такой специфической реакции на ДНК, как реакция Фельгена. [c.133]

Микрофотометрирование препарата с помощью МФ-4 можно проводить с иммерсионным объективом, внеся соответствующие изменения в оптическую часть прибора. В этом случае измерение производят по типу цитофотометрии. Разрешающая способность такого цитофотометра повышается при использовании светофильтров или монохроматора. При этом описанные выше принципы и приемы микрофотометрирования сохраняются. [c.139]

Принципы количественной цитофотометрии могут быть использованы и при облучении объекта ультрафиолетом. В этом случае применяется кварцевый или зеркальный микроскоп. Если но поглощению ультрафиолетовых лучей определяют количество пуклеиновых кислот в данном участке клетки, то предварительного окрашивания пробы не проводят. [c.124]

Метод количественной цитофотометрии был разработан и усовершенствован Каснерсоном и его сотрудниками в Стокгольме [53, 63—66]. Аппаратура, применявшаяся этими исследователями, чрезвычайно сложна. Для ознакомления с деталями ее конструкции следует обратиться к оригинальным работам. [c.124]

Сортировка X- и Т-хромосом. В работе [333, 330] осуществлена препаративная проточная цитофотометрия X- и У-хромосом человека. Х-хромосома была выделена из клеточной линии с кариотипом 48,ХХХХ с помощью однолучевой сортировки. Этот материал был использован для приготовления библиотеки хромосомной ДНК после обработки рестриктазой ЕсоК1 и клонирования в фаге (см. разд. 2.3,2,2), У-хромосома отобрана с помощью двулучевого сортера из материала гибридной клеточной линии китайский хомячок X человек . Получение клеточных гибридов будет описано в разд, 3,4,3 в связи с локализацией генов в хромосомах. Важная особенность гибридных клеток человек х мышь или [c.132]

Химический состав клетки можно определить и на основе ее физических особенностей, в частности по избирательному поглощению молекудами ультрафиолетовых, инфракрасных, а также рентгеновских лучей. Спектральное определение химического состава клеток, или так называемый метод цитофотометрии, позволяет установить не только качественное, но и количественное соотношение внутриклеточных структур. [c.9]

Во многих лабораториях при решении различных цитологических проблем используют свойства меченых радиоактивных изотопов, например фосфора ( Р), железа ( Ре), серы углерода ( С) и др. Сочетание цитофотометрии с методом ра диоавтографии дает возможность определить локализацию веществ не только в самих клетках, но и в отдельных ее органел-л ах. С применением комплексных методов — радиоавтографии, цитофотс метрии и электронной микроскопии — были получены весьма ценные данные о метаболической активности, месте синтеза и перемещении пластических веществ клетки. [c.9]

В конце 1960-х — начале 1970-х годов в результате многочисленных исследований методом цитофотометрии ДНК по Фельгену получило широкое распространение представление о существовании избыточной по сравнению с диплоидным набором ДНК в клетках мозга млекопитающих и птиц. Особенно популярной была точка зрения о тетраплоидности (в ряде случаев — и полиплоидности более высокого порядка) крупных нейронов [c.10]

Цитохимические и цитоспектрофотометриче-скне методы исследований. Для определения местонахождения и количества различных содержащихся в клетке химических веществ применяют метод цитофотометрии. Цитофотометрия проводится в видимой и ультрафиолетовой областях спектра. Под действием ультрафиолетовых лучей клеточные структуры, окрашенные специальными красителями — флуорохромами, начинают ярко светиться различными цветами на фоне несветящихся частей препарата. [c.17]

Используя спектры цитофотометра, с помощью флуоресцентного метода устанавливают не только присутствие тех или иных веществ в клетке, но и их количество. Таким образом изучают химизм клетки, отдельных ее структур и реакции обмена веществ. Цитохимическими методами в клетке определяют количество и местонахождение белков, нуклеиновых кислот, витаминов, металлов и т. д. Метод флуоресцентного анализа позволяет различать нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) и определять их количество. Важное преимущество цитохимических методов — возможность [c.17]

При цитофотометрии тонких срезов возникают определенные трудности, связанные с оптической негомоген-ностью срезов, подвергаемых гистохимической обработке. При работе со срезами одинаковой толщины возможные колебания в измерениях сглаживаются регистрацией цитофотометрических данных по большому числу клеток (от 20 до 100). При этом следует иметь в виду, что число исследуемых клеток зависит от морфологии ткани. Точность измерений можно повысить, сканируя образец узким пучком [c.310]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология