Мутагенез схема

Рис. 85. Схема сайт-специфичного мутагенеза

Образование (6-4) пиримидиновых аддуктов. Эти фотопродукты, характеризующиеся абсорбцией при 315-320 нм и флуоресценцией в области 405-440 нм, были выделены из кислотного гидролизата УФ-облученной ДНК. Структура аддуктов была установлена с помощью УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Квантовый выход (6-4)-аддуктов порядка 10 , т.е. в 10 раз меньше, чем циклобутановых димеров, и следовательно, в летальный эффект УФ-излучения (254 нм) они вносят незначительный вклад. Однако в УФ-мутагенезе они могут играть важную роль. В отличие от летальных повреждений ДНК, мутационные дефекты возникают намного реже, и поэтому для них требование максимального квантового выхода не имеет принципиального значения. Полагают, что реакция образования (6-4) пиримидиновых аддуктов идет по схеме [c.439]

Индуцированный мутагенез и отбор продуктивных мутантов до настоящего времени остается важным методом повышения активности промышленных штаммов микроорганизмов, например в селекции продуцентов антибиотиков. При этом обработанную мутагеном культуру рассеивают на плотные питательные среды с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии, а затем исследуют каждый клон на продуктивность. Выделив более продуктивный вариант, процедуру мутагенеза и отбора повторяют, т. е. проводят ступенчатый отбор. Обычно ступенчатый отбор включает этапы мутагенеза, а также выделение спонтанных мутантов. Схема получения продуцентов этим методом имеет вид перевернутого дерева (рис. 7). [c.77]

Рис. 33. Схема направленного мутагенеза по методу Т.А. Кункеля [17].

Рис. 6.5. Схема ген-направленного мутагенеза

Соотношение продуктов N(9)- и N(7)-aлкилиpoвaния также зависит от размера заместителя в положении 6 при наличии объемного заместителя в положении 6 алкилирование идет преимущественно по положению 9, а не 7 [12]. Соотношение это также зависит от природы алкилирующего агента так, при использовании акцептора Михаэля, например метилакрилата, алкилирование обратимо и концентрация термодинамического продукта может возрастать [13]. Региоспецифичное 7-алкилирование может быть проведено кватернизацией 9-рибозида с последующим гидролитическим удалением углеводного остатка, как показано на схеме [14]. Алкилирование по атому азота N(7) в нуклеиновых кислотах лежит в основе механизма мутагенеза/канцерогенеза при действии некоторых природных токсинов, таких, как афлатоксин [15]. [c.581]

Одна из наиболее упо фебляемых схем такого мутагенеза приведена на рис. 85. С этой целью исходный ген встраивают в двунитевую репликативную форму ДНК фага М13, зрелые частицы которого содержат однонитевую кольцевую молекулу ДНК (плюс-цепь, см. 5.7). Введение полученной рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки приводит к накоплению частиц бактериофага, содержащих однонитевую рекомбинантную ДНК, из которых ее можно выделить и использовать в качестве матрицы для ДНК-полимеразы. Для репликации используют специально сконструированный праймер, который соответствует участку встроенного гена, содержащему кодирующий элемент заменяемой аминокислоты. При этом по обе стороны от этого тринуклеотнда праймер полностью комплементарен рекомбинантной ДНК, а в пределах этого тринуклеотида заменен таким образом, чтобы в образующейся при репликации минус-цепи образовалась запла- [c.305]

В соответствии со схемой превращения аминокислот (см. схему 1) для снятия регуляции синтеза лизина необходимо прекратить образование треонина на стадии превращения полуальдегида аспарагиновой кислоты в гомосерин, катализируемое ферментом гомосернндегидрогена-зой. Последнее достигается посредством мутагенеза. Опыты показывают, что мутантные клетки, не образующие гомосернндегидрогеназы, при их культивировании на искусственной питательной среде обеспечивают 276 [c.276]

Новый подход к расшифровке кода, не связанный со сравнением криптограммы и текста, появился в конце 50-х годов, когда, с одной стороны, было показано, что в определенной точке полипептидной цепи мутантного белка одна аминокислота замещает другую, присутствующую в белке дикого типа, а с другой — были расшифрованы механизмы спонтанного и индуцированного мутагенеза (см. гл. XIII). Например если мутация, приводящая к замене аминокислоты а на аминокислоту , была индуцирована мутагеном, вызывающим транзиции азотистых оснований, то это означает, что кодоны, соответствующие аминокислотам а и , имеют два общих нуклеотида, а третий нуклеотид у обоих кодонов либо пуриновый, либо пиримидиновый. Если, далее, другая мутация, индуцированная мутагеном, вызывающим транзиции, приводит к замене аминокислоты а на аминокислоту у, это значит, что кодоны, соответствующие аминокислотам и Y, имеют один общий нуклеотид и различаются по двум другим нуклеотидам. Таким образом, анализируя известные замены аминокислот в мутантных белках и сопоставляя их с предполагаемыми заменами нуклеотидов, вызвавших мутации в соответствующих генах, в принципе можно построить схему взаимоотношений между аминокислотами и кодонами. Анализируя эту схему, можно попытаться расшифровать генетический код. [c.434]

Изображенная на рис. 16.2 схема проведения мутагенеза in vitro позволяет получать простые делеционные мутанты по контролирующей области гена tk (стадии 1 -3). В чем преимущества метода лин-керного сканирования (стадия 4) по сравнению с простым делеционным мутагенезом in vitro в обнаружении регуляторных последовательностей клонированных генов [c.246]

Метаболическая активация. В этом случае продукт монооксигеназной реакции становится более активным соединением, чем молекула, из которой он образовался. Типичный пример такой реакции — образование в монооксигеназной системе из бенз (а) пирена окисленных производных, способных связываться с ДНК, вызывая мутагенез и канцерогенез. Подобным образом в микросомной системе происходит метаболическая активность целого ряда проканцерогенов, включая афлотоксины. Схема участия различных изоформ цит. Р-450 в метаболизме [c.139]

Метод прямого использования мутаций рассчитан на быстрое создание исходного материала с нужными признаками и свойствами. Однако прямое и быстрое использование мутаций при тех высоких требованиях, которые предъявляются к современным селекционным сортам, далеко ие всегда дает положительные результаты. Полученный вследствие мутагенеза исходный материал должен, как правило, пройти через гибридизацию. Это второй путь использования искусственных мутаций. Мутации могут изменять фенотипическое выражение в зависимости от того, в какой генотип они включаются. Особенно это относится к малым физиологическим мутациям. Поэтому скрещивание качественно меняет влияние отдельных мутаций иа развитие многих признаков и свойств. Широко применяются сочетание индуцированного мутагенеза с гибридизацией обработка мутагенами гибридных семян Ро, р1 и старших поколений скрещивание мутантных форм между собой и с лучшими районированными сортами беккроссовая гибридизация, которая проводится по схеме [c.217]

Многие успехи современной молекулярной биологии и селекции микроорганизмов основаны на применении индуцированного мутагенеза in vivo (см. гл. 2). Типичная схема опыта по получению мутантов бактерий и фагов заключается в обработке клеток мутагеном и скрининге среди потомков клеток с измененным фенотипом. Далее следует огромная работа, связанная с картированием мутаций, доказательством отсутствия других мутаций, влияющих на фенотип. Хотя метод этот чрезвычайно трудоемок, он обладает тем преимуществом, что не нуждается в предварительных гипотезах и знаниях относительно роли того или иного белка в проявлении данного фенотипа. Метод мутагенеза и ступенчатого отбора позволяет вести селекцию продуктивных штаммов микроорганизмов, недостаточно генетически изученных, и получать продуценты метаболитов, для которых не установлен путь биосинтеза. Велико значение индуцированного мутагенеза как поставщика новой информации для исследователей, занимающихся молекулярной биологией и биохимией. Расшифровка на молекулярном уровне новых мутантных фенотипов открывает возможности выяснения путей биосинтеза и ре-гуляции метаболизма нормальной клетки. [c.159]

Все мероприятия по выявлению I енетически активных факторов направлены на сведение к минимуму контактов человека с мутагенами. Новые химические соединения и другие генетически активные агенты изымаются из употребления или их применение строго ограничивается. В тех же случаях, когда человек вынужден с ними соприкасаться, необходимо иметь в резерве средства минимизации риска мутационных и канцерогенных изменений. Для этого необходимо знать пути мутагенеза и уметь вмешиваться в этот процесс. Становление мутации — процесс многоэтапный. В упрощенном виде его мож1Ю представить так, как это показано на схеме рис. 21.5. Многие мутагены, попадая в организм, включаются в цепи метаболических превращений и затем могут как активироваться, т. е. приобрести или повысить свою генетическую активность, так и инактивироваться, т. е. потерять ее. При этом необходимо учитывать организменные и клеточные барьеры проницаемости и способ попадания соединения в организм через кожу дыхательные пути и т. д. [c.541]

Рис. 34. Схема направленного мутагенеза с использованием ПЦР и рестриктазы Орп1 [22

Рис. 8.1. Схема олигонук-леотидного мутагенеза. Показаны основные стадии мутагенеза при использовании бактериофага MI3. Подробное описание методики можно найти в работах, цитируе.тх в тексте.

Как можно видеть из приведенных схем, наибольшее число консервативных участков локализовано в имеющемся у всех ферментов (что вполне естественно) домене, отвечающем за полимеразную активность. Некоторые из этих участков связываются с ДНК, а другие с дНТФ и ионами магния. Этому домену предшествует домен, выполняющий редактирующие функции в виде 3 — 5 -экзонуклеазной активности. У термостабильных ДНК-полимераз в этом домене имеется только один консервативный участок (Taq ДНК-полимераза) или они все отсутствуют (Bst ДНК-полимераза), вследствие чего оба этих фермента лишены подобной редактирующей активности. КН2-терминальный домен у ДНК-полимеразы I несет репарирующую 5 — З -экзонуклеаз-ную активность. Подобную активность проявляют обе упомянутые выше термостабильные ДНК-полимеразы, что, вероятно, объясняет обнаруженную у них некоторую гомологию этого участка с аналогичным у ДНК-полимеразы I. Что касается большинства ДНК-полимераз, модифицированных с целью их большей пригодности для ферментативного секвенирования ДНК либо ограниченным протеолизом, либо специально созданных генно-инженерным путем, то их объединяет общая черта, заключающаяся в удалении имеющейся у их предшественников 5 — 3 -экзонуклеазной активности. Путем делеции нескольких аминокислотных остатков во втором экзонуклеазном домене Т7 ДНК-полимеразы была убрана имевшаяся 3 — 5 -экзонуклеазная активность. Сайтнаправленный мутагенез двух аминокислот в экзонуклеазном домене Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I привел к удалению 3 —> 5 -экзонуклеазной активности этого фермента. Как можно представить из приведенных схем, столь разные структурные организации рассматриваемых ферментов не могли не сказаться на особенностях их ферментативного действия, чему и будет посвящено дальнейшее изложение. [c.83]

Однако использование молекул РНК в качестве носителей алкилирующих групп имеет ряд ограничений. В частности, при этом исключается возможность получения мутаций в не-транскрибируемых районах генома. Кроме того, выделить мРНК, транскрибированные с отдельных генов, в больпшнстве случаев довольно сложно. С другой стороны, набор известных рестриктаз позволяет получать фрагменты ДНК практически из любого участка изучаемого генома. Решение данной задачи значительно упрощается при использовании ПЦР. Выбранные фрагменты могут быть клонированы и амплифицированы в составе гибридных ДНК. Поэтому было решено заменить мРНК одноцепочечными фрагментами ДНК. На примере мутагенеза гена tet плазмиды pBR322, осуществленного по схеме, во многом аналогичной приведенной на рис. 6.5, была показана возможность индукции направленных мутаций с помощью одноцепочечных фрагментов ДНК, несущих алкилирующие группы. [c.176]

Pu . 6.6. Схема мутагенеза гена/З-шобина кролика в районе участка ЕсоШ. [c.177]

С. Хирозе с соавторами (1982 г.) предложили использовать азотистую кислоту для эффективного сегмент-направленного мутагенеза. Поскольку HNO2 может воздействовать и на двухцепочечную ДНК, схема процедуры выглядит следующим образом. С двухцепочечной кольцевой молекулой ДНК, имеющей одноцепочечную брешь, гибридизуют одноцепочеч- [c.180]

К. Норрис с соавторами разработали другую схему, позволяюгцую преодолеть затруднения с полной достройкой второй цепи ДНК (рис. 6.14). Для этого используют два праймера, один из которых — мутаген, но полимеразно-лигазную реакцию не ведут до конца. Из частично двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктаз выщепляют подвергаемый мутагенезу двухцепочечный фрагмент и клонируют его в векторной плазмиде. В результате уровень мутантов по гену ompF (белок внешней мембраны Е. oli) достигал 42 % проанализированных клонов трансформантов Е. соИ. [c.185]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология