Антигены иммобилизованные

Для проведения такого анализа необходимо эффективное отделение комплексов от свободных компонентов. Эта задача достаточно легко решаема, если антиген, либо антитело иммобилизовать на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и разделить иммунные комплексы и свободные компоненты. Возможность прочного связывания на носителе антигенов или антител с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов привела к созданию твердофазных иммунохимических методов, широко используемых в настоящее время в химическом анализе. [c.114]

В том случае, когда количество исследуемого антигена достаточно только для первоначальной иммунизации, используют другой вариант иммуноаффинной хроматографии, разработанный сравнительно недавно. Полученные антитела иммобилизуют на нерастворимом носителе и экстракт, содержащий антиген, наносят на колонку. Десорбцию осуществляют обычным способом. Однако при приготовлении сорбента, сорбции и элюировании необходимо иметь в виду высокую лабильность антител в присутствии денатурирующих агентов. [c.188]

Для упрощения сравнения в. таблице приведена суммарная концентрация иммобилизованных антител без деления на концентрации центров, обладающих большим и меньшим сродством к антигену. На сорбентах 1—3 иммобилизована 1дО-фракция антисыворотки на сорбенте 4 — аффинно выделенные антитела. [c.219]

Если иммуносорбент с иммобилизованными антителами предполагают использовать прежде всего для извлечения из смеси определенного антигена (но не для получения его в чистом виде), фиксацию антител можно осуществить по типу сэндвича . Первоначально иммобилизуют на носителе такой же антиген пли антиген, перекрестно с ним реагирующий, а затем к иммуносорбенту добавляют большой избыток антител (антисыворотка). Часть активных центров антител, присоединенных к иммобилизованному антигену, окажется свободными. Именно за счет них сэндвич -сорбент будет связывать определенный антиген из раствора. [c.243]

В методах иммуноанализа, основанных на использовании системы комплемента (рис. 9-1), антигены, такие, как теофиллин или тироксин, сначала иммобилизуют, т. е. присоединяют к поверхности липосом, содержащих фермент-маркер. Свободный антиген из образца конкурирует с иммобилизованным антигеном за связывание с антителами, причем для активации каскада реакций системы комплемента необходимо, чтобы два связавшихся антитела оказались в непосредственной близости [c.124]

Антитела к тестируемому компоненту вначале иммобилизуют на поверхности фильтровальной бумаги. Фильтры с антителами вставляют в пластиковые рамки и помещают в соответствующие ячейки для последующего их автоматического перемещения. После высушивания эти фильтры достаточно стабильны. Как показано на рис. 20-1, их можно использовать для проведения трех вариантов анализа. При последовательном анализе образцы, содержащие искомый антиген, наносят на сухие фильтры на 2 мин. Затем добавляют избыток конъюгата тестируемого антигена с ферментом для насыщения всех непрореагировавших центров связывания, оставшихся на поверхности фильтра. Спустя 3 мин в центр фильтра наносят раствор субстрата таким образом, чтобы избыток не связавшегося с антителами конъюгата вымывался по принципу радиальной хроматографии. Последний этап является ключевым для данного метода ИФА и общим для всех трех вариантов анализа. [c.298]

Другой вариант применения моноклональных антител связан с возможностями аффинной очистки антигена. Моноклональные антитела, чувствительные к изменению pH, могут быть иммобилизованы на носителе и использованы для избирательного удаления антигена из сложной смеси. При промывке такого сорбента буфером с соответствующим значением pH элюируется искомый антиген (рис. 24-6). [c.396]

Ключевым фактором успешного развития СВО-приборов для иммуноанализа является иммобилизация одного из компонентов иммунохимической пары на поверхности ЭВО. Методика иммобилизации должна не только удовлетворять таким требованиям, как воспроизводимость, захват большого количества белка, сохранение иммунохимической активности и устойчивости, но и не вызывать химических или физических изменений на поверхности, которые могли бы приводить к нежелательным оптическим эффектам (например, рассеянию света). Поскольку в большинстве работ по данному вопросу использовали кварц или стекло, мы ограничимся обсуждением только этих материалов. Кроме того, в дальнейшем мы будем рассматривать только иммобилизацию белков. На поверхностях ЭВО можно иммобилизовать и многие антигены небелковой природы. Для этого используют химические реакции, пригодные лишь для определенных соединений, поэтому здесь мы их также не будем обсуждать. Отметим, однако, один из подходов к решению данной проблемы, состоящей в том, что на ЭВО наносят белок (например, бычий сывороточный альбумин), с которым затем связывают его небелковый антиген [24]. [c.528]

В этом методе пробу фильтруют через мембрану, в которой иммобилизована захватьгаающая молекула (антитело или антиген). Затем в фильтрате определяют иесвязанлое вещество. Использование волоконных мембран увеличивает площадь поверхности, а значит, и емкость связывания используют стекловолокно и волокно целлюлозы, ио чаще материалом мембраны служит иайлон. Улучшение взаимодействия может быть получено при иммобилизации захватывающей молекулы на частицах полимера (как описано вьппе), которые затем улавливают в мембране. [c.580]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Одним из важных моментов в проведении иммуноферментного анализа является разделение свободных и связанных с антителами меченых компонентов. В настоящее время разработано несколько вариантов решения данной проблемы. Наиболее распространен метод, основанный на иммобилизации антител на твердой подложке (стеики полистирольных пробирок или шариков, целлюлозные диски, гранулы макропористых носителей для хроматографии). Особенно перспективными оказались полистироло-вые пробирки или планшеты, содержащие 96 лунок. Сущность методов разделения основана на том, что одни из компонентов, например антитела, могут быть сорбционно иммобилизованы на поверхности измерительной кюветы. После проведения инкубации с образцом антиген сорбируется на поверхности, а все остальные компоненты остаются в растворе и могут быть легко отделены, например, с помощью пористых частиц под действием магнитного поля. Основными проблемами, возникающими при реализации твердофазных методов разделения, являются стандартизация поверхности и уменьшение неспецифического связывания меченых компонентов с носителем. [c.114]

На нерастворимом носителе (сефароза, целлюлоза) могут быть иммобилизованы антитела, так что с помощью такого сорбента можно извлечь из смеси антигенов определенный антиген. Ковалентное связывание антител с носителе.м производят по возможности в мягких условиях, чт )бы исключить их денатурацию. В связи с необходимостью фиксировать большие количества белка для приготовления иммуносорбеита крайне редко используют очищенные антитела. Обычно используют выделенные из антисыворотки иммуноглобулины. [c.242]

Емкость сорбентов с антителами значительно ниже,, чем с антигеном, по следующим причинам 1. Число активных центров в антителах, содержащихся в антисыворотке в наибольших количествах, а именно IgG, равно двум число детерминант в молекуле антигена, как правило, больше. 2. Стерический фактор при иммобилиза- [c.242]

При изучении аитител к антигенам клеточной поверхности обычно использовалнсь свежие нли фиксированные клетки в суспензии, что требовало затраты времени на центрифугирование. Недавно был описан метод (Sto ker, Heusser, 1979), в котором клетки иммобилизуются иа поверхности пластика и используются как нерастворимый антиген для различного рода иммунологических реакций. Ннже описаио применение этого [c.329]

При выполнении анализа образец, содержащий антиген, добавляют к ферментному реагенту и какое-то время перемешивают, Затем край индикаторной полоски погружают в полученную смесь ферментного реагента с раствором антигена и дают жидкости подняться по полоске под действием капиллярных сил. На этом этапе полоска поглощает ограниченное и воспроизводимое количество раствора. Антиген и ферментный конъюгат, перемещаясь по полоске, иммунологически связываются с иммобилизо- [c.150]

Другим плодотворным приемом оказалось использование двойных и тройных иммунных систем, когда, например, к первоначальным комплексам антиген—антитело присоединяются антитела, полученные от другого животного, иммунизированного сывороткой первого донора. Эти так называемые вторичные антитела узнают антитела, входящие в состав первичного иммунного комплекса, поскольку для второго животного первичные антитела являются антигенами. Кроме того, в систему можно ввести еще и белок А, способный присоединяться к одинарному или двойному иммунному комплексу, поскольку константная часть соответственно первичного или вторичного антитела в этих комплексах остается свободной. Белок А можно иммобилизовать Hii некоей матрице, создав тем самым сорбент для антител и иммунных комплексов. Этот белок можно использовать и прямо в составе бактериальной стенки. Убитые, но не разрушенные бактерии Staphylo o us aureus, за счет белка А способны связывать иммунные комплексы, в результате чего преципитация этих комплексов из раствора сводится к осаждению бактерий низкоскоростным центрифугированием. [c.270]

Уравнение (26.31) позволяет предсказать предел обнаружения антигенов с помощью ИМПТ и диапазон определяемых содержаний. Если принять, что константа равновесия лежит обычно в диапазоне от 10 до 10 [35], р равно 10 , поверхностная концентрация иммобилизованных антител равна 1 молекуле на 10 нм , заряд антигена равен пяги элементарным зарядам, а минимальный измеримый сигнал - 10 мВ, то предел обнаружения должен составить от 10 до 10 М. Аналогично можно рассчитать, что концентрация антигена, при которой достигается покрытие 90% поверхности, равна 10 -10 М. Отсюда следует, что теоретический диапазон отклика ИМПТ равен трем порядкам. Этот диапазон можно расширить, если иммобилизовать смесь антител с различными константами равновесия. [c.414]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология