ДНК ретровирусная

Рнс. 161. Схема интеграции ретровирусной и клеточной ДНК [c.313]

Рис. 162. Схема синтеза ретровирусных РНК

HIV-1. Практически эта задача оказалась чрезвычайно сложной и на сегодняшний день нерешенной Среди требований, предъявляемых к свойствам ингибиторов, главное и самое трудновыполнимое касается избирательности их действия. Ингибиторы, обладающие терапевтическим эффектом, должны быть прежде всего высокоспецифичны до такой степени, чтобы дезактивируя ретровирусную протеиназу, не нарушать нормального функционирования как аспартатных, так и других протеолитических ферментов клетки-хозяина. Для целенаправленного поиска ингибиторов, удовлетворяющих этому требованию, необходимо располагать количественными данными о всех стадиях катализа вирусной протеиназы и механизмах функционирования протеиназ инфицированной клетки, а также владеть методом решения обратной структурной задачи, те конструирования химического строения ингибитора по заданной пространственной форме. Вероятность обнаружения таких ингибиторов экспериментальным или эмпирическим путем мала. Помимо того, что этот путь ненадежен, он чрезвычайно дорогостоящ и продолжителен На несовершенство используемого подхода, допускающего исследование только в направлении от функции к структуре, указывают разработанные схемы катализа аспартатных протеиназ. Они интересны в том отношении, что исходят по существу из одного и того же экспериментального материала, включающего данные рентгеноструктурного анализа и результаты многочисленных биофизических и биохимических исследований, а также базируются на одинаковых традиционных, теоретических представлениях о природе биокатализа. При единстве исходного опытного материала, теоретической основы и в рамках одного подхода были предложены пять различных стереохимических моделей функционирования аспартатных протеиназ, которых, впрочем, могло быть и больше [363-366]. [c.546]

Рис. 160. Схема образования двухнитевой ретровирусной ДНК

Использование ретровирусных векторов Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рис. 19.1), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии. [c.419]

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных [c.439]

ДНК ретровирусного вектора можно использовать для трансформации клеток саму по себе, но эффективность доставки ее в ядро и интеграции в геном клетки-хозяина крайне низка. Поэ- [c.488]

Рис. 21.3. Генетическая карта ретровирусного вектора, несущего два гена. Транскрипция терапевтического гена (Ген X) контролируется 5 -LTR-промотором, транскрипция селективного маркерного гена (Neo ) — внутренним промотором (р). 3 -LTR содержит сигнал полиаденилирования. - последовательность, ответственная за упаковку.

Манн и др. сконструировали первую клеточную линию для упаковки ретровирусов. Для этого они встроили вирусный геном с предварительно удаленной нуклеотидной последовательностью, ответственной за упаковку, в хромосому клеточной линии, которая в этих условиях производит неинфекционные вирусные частицы. После трансфекции этих клеток ДНК-конструкцией, которая содержала последовательность, необходимую для упаковки, и терапевтический ген, но не содержала ретровирусные гены. [c.492]

В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделящиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр [c.493]

Существует ряд векторов на основе ретровирусного генома. В простейших случаях удаляют структурные гены и на их место встраивают один или больше рестрикционных сайтов в целях [c.584]

Ретровирусный вектор может включить лишь около 10000 пн. Имея в руках готовый вирусный вектор, им можно инфицировать подходящие клетки-мишени, например, фибробласты, экспрессирующие соответствующие поверхностные рецепторы. [c.585]

В 1990 г. в США двое детей в возрасте 4 и 9 лет были выбраны для генной терапии. В выделенные лимфоциты детей с помощью ретровирусного вектора был встроен нормальный ген аденозиндезаминазы и после этого лимфоциты вернули на место. Лечение нужно было повторять каждые 1—2 месяца. Через год было отмечено заметное улучшение дети проявляли иммунный ответ и начали ходить в школу. [c.265]

Рис. 38.1. Ретровирусные РНК кончаются прямыми повторами (R), а свободные линейные ДНК-последовательностями LTR

Рис. 160. Схема образования двухнитевой ретровирусной ДНК Тонкнелиннн — цепи РНК 1а том числе волнистая — па 1и(А), крестообразная структура — тРНК Затравка] жирные линии — цепи ДНК остальные обозначения см. текст

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым бьи имплантирован эмбрион ( суррогатные матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мьщ1ат, несущих трансген в клетках зародьшгевой лршии, проводят ряд скрещиваний.

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференци-ровке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (Е5). Е8-клет-ки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипо-тентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем. [c.422]

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5 "-концевой участок гена gag и 5 - и 3"-LTR, а затем рядом с / -областью встраивают терапевтический ген, транскрипция которого будет контролироваться 5"-LTR-промотором при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором (рис. 21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена, На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, - примерно 8 т. п. н. [c.488]

В пакующей клеточной линии не образуются компетентные по репликации ретровирусы дикого типа, способные встраиваться в гены и приводить к некотролируемой пролиферации некоторых клеток (т. е. к превращению их в раковые клетки). Это весьма существенно, особенно если частицы ретровирусного вектора предполагается использовать для геной терапии соматических клеток человека. В качестве меры предосторожности все же проводят регулярное тестирование готовых ретровирусных векторов, с тем чтобы выявить ретровирусы дикого типа. Кроме того, в пакующей клеточной линии нуклеотидные последовательности ретровируса и вектора локализованы в трех разных областях хромосомы, что делает весьма маловероятной возможность последовательных рекомбинационных событий, которые могли бы привести к образованию компетентного по репликации ретровируса. [c.489]

Рис. 21.4. Получение упакованного ретровирусного вектора. В двух разных участках хромосом пакующей клеточной линии содержатся ретровирусные гены в одном - gag, в другом — pol и env. Их транскрипция контролируется 5 -LTR-np0M0T0p0M оба участка лищены последовательности, необходимой для упаковки Па-

К сожалению, тотинотентные стволовые клетки очень трудно выделять из костного мозга и культивировать. Исследования по ех vivo-ген-ной терапии S ID, вызванного дефицитом АДА, проводили на аутологичных Т-клетках, модифицированных с помощью ретровирусных векторов. Т-лимфоциты имеют ограниченное время жизни, поэтому необходимо проводить их повторные инфузии. В первом испытании двум девочкам вливали с интервалом в несколько месяцев собственные генетически исправленные Т-клетки, продуцирующие АДА. Наблюдаемый положительный эффект, возможно, объяснялся снижением уровня аденозина и дезоксиаденозина в крови и предотвращением гибели В- и Т-клеток. [c.491]

Генная терапия in vivo предполагает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента (рис. 21.6). Ретровирусные векторы проникают только в делящиеся клетки-мишени, однако во многих тка- [c.493]

При генной терапии ех vivo терапевтический ген переносят в изолированные клетки больного с помошью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех vivo использует генноинженерную модификацию неаутологичных клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению терапевтического генного продукта. [c.510]

Плазмовирус (Plasmovirus) Генетическая конструкция, которая содержит ретровирусные гены, находящиеся под контролем 5-LTR-npoMOTopa, а также терапевтический ген и ген env, управляемые цитомегаловирусным промотором. [c.556]

Как уже было сказано в начале этого раздела, другим методом получения трансгенных животных (в частности, мышей) является заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих целей. Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные гены ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис-сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственна копия ретровирусного генома ДНК прочно и строго определённым образом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экспрессии клонированных генов заметно повышается вследствие того, что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипционные энхасеры, или усилители (см.). Известные ретровирусные векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей (MLV) или от вирусов птиц (ALV). [c.584]

Каждая вирусная частица содержит две копии одноцепочечного РНК-генома, а после проникновения в пермиссивную клетку этот геном переводится в линейную двухнитевую ДНК под влиянием вирусного фермента — обратной транскриптазы. Чтобы интегрироваться в клеточный геном клетки-мишени, линейная ДНК проникает в ядро, где приобретает кольцевидную форму. Интегрированная линейная ДНК-копия ретровирусного генома (провирус) имеет на обоих концах длинные нуклеотидные повторы — LTR (от англ. long termine repeats). 5 LTR несет промотор, с которого начинается транскрипция генов интегрированного провируса 3 LTR-сайт полиаденилирования, где происходит терминация РНК-транскриптов (см. рис. 23). [c.584]

Сильными антигенпрезентирующими свойствами при вирусных инфекциях обладают дендритные клетки, а при простом герпесе и ретровирусных инфекциях — клетки Лангерганса. [c.29]

Ретровирусные векторы.В опытах han A.W.S. et al. (1998) трансгенные телята были получены путем введения гена с ретровирусным вектором непосредственно в ооцит. Несмотря на то что эта система ограничена размером трансгенов в связи с ограничениями ретровирусного вектора, она представляет альтернативный метод, по крайней мере, для тех видов, у которых возможно оплодотворение in vitro. [c.230]

В геноме ряда вирусов имеются элементы, несущие ту же функцию, что и 72-нуклеотидная последовательность вируса 8У40, хотя они не гомологичны друг другу. В пользу предположения о том, что эти элементы могут выполнять сходные функции, свидетельствует тот факт, что аналогичные компоненты генома ретровирусов могут заменять энхансеры в ДНК вируса 8У40. Возможно, что эта часть ретровирусной ДНК вовлечена в активацию клеточных генов. [c.154]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология