Электрофорез прерывистый

Ниже будут описаны две буферные системы для обычного электрофореза— прерывистая (неоднородная, или дискретная) и непрерывная (однородная). Последняя весьма проста один и тот же буфер используется в процессе всего электрофореза, так что в электрофоретическом канале не происходит изменения состава буфера. Чтобы уменьшить потери напряжения на участках, соединяющих электроды с истинным электрофоретическим каналом, можно использовать буферные растворы большой концентрации (рис. 5.18, Л). Обычно применяют буферы с суммарной ионной силой порядка 0,05—0,15. Это — компромисс между низкой проводимостью, позволяющей применять высокое напряжение, но способствующий белок-белковым взаимодействиям, и системой с минимумом таких взаимодействий, но более высокой проводимостью, в результате чего возникает проблема нагрева. Нагрев можно уменьшить, снизив силу тока. [c.222]

Методика. Разделяющий гель, содержащий ДСН, приготавливают так, как это описано выше для электрофореза в неоднородной ( прерывистой ) системе. Однако в данном случае концентрирующий гель не используется и образец наслаивают непосредственно на поверхность разделяющего геля. [c.273]

В отличие от однородной системы, где в геле и в обеих камерах используется один и тот же буфер, при диск-электрофорезе используются буферы с различными pH, что создает прерывистые градиенты электрического потенциала и pH. Система включает крупнопористый концентрирующий гель с низким pH, расположенный над мелкопористым разделяющим гелем с высоким pH. Полипептиды быстро проходят через крупнопористый гель и концентрируются на поверхности разделяющего геля. Это позволяет получить хорошее разделение при использовании относительно больших объемов разведенных белковых растворов. [c.95]

Максимальное разделение достигается при использовании диск-электрофореза в ПААГ. (Название диск — от дискретного напряжения электрического поля, что обеспечивается прерывистым градиентом pH в системе.) Суть метода заключается в следующем. В стеклянной вертикальной трубке полимеризуют гель неодинаковой концентрации. Верхняя часть (область образца до 100 мкм толщиной) и средняя (прокладка) имеют меньшую концентрацию, чем нижняя часть — разделяющий гель. Образец наносят на верхнюю часть геля. (Иногда верхний гель [c.113]

Прибор для диск-электрофореза показан на рис. 4.7. Он состоит из двух сосудов с буфером — верхнего и нижнего, соединенных, между собой рядом вертикальных цилиндрических стеклянных, трубок (рабочие трубки), содержащих гель (рабочий гель и гель-прокладку). В нижнем сосуде находится анод, а в верхнем — катод. Образцы наносят на поверхность столбиков геля при заполненном буфером нижнем сосуде, затем буфером заполняют и верхний сосуд, ставят на место крышку и включают ток. Буферные растворы подбирают таким образом, чтобы разделяемые вещества были в них. заряжены отрицательно. По мере их движения через гель вниз, к. аноду, происходит разделение, обусловленное различиями отношений заряда к массе. Диск-электрофорез называют еще прерывистым электрофорезом (в отличие от непрерывного, проточного). Это название отражает особенность метода, заключающуюся в использовании неоднородной ( прерывистой ) среды (гелей) и буферов разного состава и с разными значениями pH. Верхняя треть-столбика геля состоит из крупнопористого геля-прокладки, или концентрирующего геля, а нижняя — из рабочего, или разделяю-щего, геля с более мелкими порами. [c.131]

Изотахофорез представляет собой также разновидность электрофореза в ПАГ с использованием прерывистой буферной системы, в которой ведущий ион имеет высокую под вижность, а замыкающий — низкую, что обеспечивает высокую разрешающую способность метода, [c.148]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

Принцип метода. Миграция и разделение белков происходят в небольших цилиндрических колонках полиакриламида. [Термин диск-электрофорез происходит от дископодобной формы фрагментов колонки геля, в которых содержатся фракции, а также от английского слова dis ontinuous , которым названа неоднородная ( прерывистая ) буферная система, обычно используемая в этом методе.] [c.88]

Диск-электрофорез в его многочисленных вариантах, позволяющий проводить разделение макромолекул, стал в астоящее время очень важным методом, применяемым в биологических и медицинских исследованиях, а также в клинической диагностике и промышленности (для контроля за технологическими процессами). С тех пор как в 1959 г. Орнстейн [67] и Дэвис [64] впервые описали метод прерывистого электрофореза, проводится широкое изучение всех аспектов гель-электрофореза, в результате чего был внесен большой вклад в разработку теории этого метода, получена подробная информация [c.258]

Разделение белков в прерывистой системе зависит от двух основных факторов 1) различий в подвижности белков, обусловленных присущим поперечно-сшитым гелям молекулярно-ситовым эффектом, обеспечивающим разделение молекул в соответствии с их размерами, и 2) различий, связанных с зарядом молекул. Кроме того, необычно четкие зоны образуются благодаря концентрированию белков в виде очень узкой полосы или диска перед вхождением их в разделяющий гель. Таким образом, величина молекулярно-ситового эффекта зависит от степени поперечной сшивки, которая в свою очередь определяется концентрацией сшивающего акриламида. Концентрирование белков в виде узкой полосы, перед тем как они входят в разделяющий гель, характерно для прерывистого электрофореза. Оно происходит в результате искусного использования неоднородного ( преры- [c.259]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

Использование персульфата для полимеризации позволяет получать гели с различной пористостью и электрофоретическими свойствами. Поэтому важно, чтобы полимеризация проходила при стандартных условиях. Персульфат может вызывать артефакты, которых легко избежать, если заменить персульфат рибофлавином и использовать фотолитическую полимеризацию вместо химической или применять восстанавливающие агенты, например тиогликолат (0,01—0,001 часть на 1 часть глицина в буфере). С той же целью можно добавлять мер-каптоэтанол (5 мМ) в концентрирующий и стартовый гели и в верхний буфер. Для удаления персульфата и других примесей иногда проводят предварительный электрофорез, но это нарушает прерывистость электрофоретической системы, превращая ее в однородную систему, что не всегда позволяет достичь нужного разрешения. [c.266]

Прерывистая электрофоретическая элюция. Чтобы избавиться от разведения выделяемых фракций, некоторые исследователи предпочапают использовать метод прерывистой элюции [175, 666, 1083, 1128]. В данном случае в ходе опыта электрофорез неоднократно прерывают и элюат каждый раз удаляют. Пай-дак [958] описал очень простой прибор, предназначенный для этой цели (рис. 47). Гель получают в стеклянной трубке длиной 70 мм и диаметром 30 мм, охлаждаемой снаружи электродным буферо м. Через середину геля проходит внутренняя трубка длиной 100 мм и диаметром 5 мм, оканчивающаяся в элюционной камере, ограниченной снизу диализной мембраной. Периодически через эту трубку пипеткой отсасывают буфер, содержащий элюированные белки, а в камеру вновь заливают Схематическое изображение прибо- [c.121]

Из сказанного следует, что при электрофорезе в однородных гелях нельзя добиться максимального разрешения липопротеидов. Для получения более четкого разделения этих белков было предложено использовать ступенчатые градиенты концентрации геля 3,5 и 7% [1445] или 3,25 и 7,5% [375], а также непрерывный градиент концентрации от 2 до 6,5% [1032]. В последнем случае ЛОНП хорошо отделяются от ЛНП, которые в свою очередь разделяются на один основной и несколько минорных компонентов. Таким образом, с помощью прерывистого или непрерывного градиента концентрации геля можно фракционировать как ЛНП, так и ЛВП. [c.358]

Для достижения максимального разделения используют диск-электрофорез— важное усовершенствование зонального электрофореза. (Как будет видно, термин диск относится не к форме полос, получаемых в этом методе, а к тому, что в системе используются неоднородные значения pH, что приводит к прерывистому напряжению.) Метод состоит в том, что первоначальный тонкий слой образца (1—2 мм) концентрируется в сверхтонкую стартовую зону толщиной от 1 до 100 мкм, как показано на рис. 9-12. Заметим, что гель находится в вертикальной колонке и представляет собой три отдельные области верхнюю, или область образца, среднюю, называемую прокладкой, и нижнюю, состоящую из собственно разделяющего геля. Область образца и гель-прокладка имеют меньшую концентрацию (больший размер пор), чем разделяющий гель, и готовятся в бустере с низкой ионной силой и различными значениями pH. Больший размер пор верхних слоев геля означает, что молекулы в них задерживаются меньше, двигаясь при этом быстрее, чем в нижнем геле. Кроме того, меньшая ионная сила обусловливает большее электрическое сопротивление, поэтому электрическое поле (Б/см) в верхнем геле больше, что также приводит к большей скорости движения молекул в верхнем геле по сравнению с нижним гелем. Соотношение значений pH по слоям приводит к такому же влиянию на подвижность. Быстрое движение через верхние слои геля приводит к накопле [c.235]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология