Белки методы фракционирования

Высаливание белков концентрированными растворами солей является одним из основных методов фракционирования белковых смесей на альбумины и глобулины. Понижения растворимости белков можно достичь также добавлением спирта и действием низкой температуры. На сочетании действия спирта, солей и охлаждения основаны способы детального фракционирования белковых смесей по Кону например, из сыворотки крови этим путем выделено свыше 12 белков. [c.369]

Одним из широко применяемых методов фракционирования белков является высаливание нейтральными солями. Впервые этим способом были отделены глобулины от альбуминов. Глобулины осаждаются при 50%-ном насыщении сернокислым аммонием, а альбумины — при более высокой концентрации. Сульфат натрия, обладая меньшей растворимостью, чем сернокислый аммоний, осаждает только глобулины. [c.59]

Этот метод фракционирования основан на уменьшении растворимости белков в присутствии органических растворителей, что обусловливает возрастание агрегации молекул белка, вызываемое уменьшением диэлектрической проницаемости среды [c.60]

При выделении фермента используют метод фракционирования белков путем изменения pH. Очистка фермента на этой стадии достигается за счет денатурации белков, которые отделяют центрифугированием. Изменение pH белкового раствора следует осуществлять осторожно, по возможности не использовать сильные кислоты и щелочи. Рекомендуется добавлять уксусную кислоту, трис-буфер, карбонат натрия и др. Добавление соответствующего буфера или кислоты проводят на холоде. Их вносят по каплям, по стенке сосуда, при постоянном перемешивании. После нейтрализации раствора проводят короткую инкубацию при 25—30° С, чтобы перед центрифугированием произошла полная агрегация денатурированных белков. [c.199]

В качестве примера высокоэффективного метода фракционирования при помощи органического растворителя можно привести метод фракционирования белков плазмы крови человека. Разделение основано на применении последовательно различных концентраций этанола, различных буферов, обеспечивающих на каждом отдельном этапе необходимую (различную) ионную силу и ионный состав. В составе буферов использовались ацетат натрия, глицин, цитрат натрия, ацетаты цинка, бария, уксусная, лимонная кислоты, компоненты фосфатного буфера. Осаждение вели при температурах —5°, —6—7°С, в различных зонах pH, примерно от 5,5 до 6,7. Точное выполнение условий pH, ионной силы и температуры имеет в этом сложном методе решающее значение. [c.146]

Высаливание лежит в основе одного из методов фракционирования высокомолекулярных веществ, поскольку способность этих соединений выделяться из раствора весьма сильно зависит от их химической природы и резко возрастает с увеличением молекулярного веса. Особенно широко применяется фракционирование с помощью высаливания для разделения белков. При этом высаливание часто сочетают с введением в систему нерастворителя (например, спирта) и охлаждением раствора. Высаливание белков целесообразно проводить при значении pH, близком к изоэлектрической точке, так как при значении pH, большем или меньшем изоэлектрической точки, возрастает заряд и гидратация белковых молекул и увеличивается их растворимость. [c.466]

В последние три года (1981 — 83 гг.) опубликовано довольно много работ по гель-фильтрации белков методом ЖХВД, и число примеров можно было бы умножить. Однако это вряд ли целесообразно, так как в большинстве случаев авторы ставят иеред собой одну и ту же (на наш взгляд, не самую важную для биохимика) задачу — про-вест1Г процесс гель-фильтрации белков или НК с максимальной скоростью, не очень заботясь о повышении его эффективности. С иных позиций выступила в начале 1982 г. фирма LKB , специалисты которой имеют давний и общепризнанный опыт в области методов фракционирования биологических макромолекул. [c.159]

Среди методов фракционирования ферментов и иных белков все возрастающее внимание привлекает сейчас ионообменная [c.150]

Фракционирование белков методом гель-фильтрации используется довольно редко, очевидно, ввиду низкой (по сравнению с другими хроматографическими методами) эффективности, присущей самому процессу (см. выше). Однако в тех случаях, когда число компонентов белковой смеси заведомо невелико, такое фракционирование может оказаться вполне эффективным приемом. Так, четыре главных белка вируса рака молочной железы мышей были успешно разделены по молекулярной массе методом гель-фильтрации их ком- [c.139]

II. МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ [c.88]

При фракционировании белков методом ионообменной хроматографии большое внимание уделяют выбору ионообменника (природе матрицы и емкости ионита) и буферного раствора, при котором осуществляется сорбция белков (величине pH и ионной силы, природе буфера и буферной емкости). [c.108]

Высаливание белков концентрированными растворами ЫагЗО или (NH4)2S04 применяется при выделении ферментов из экстрактов тканей и является одним из методов фракционирования белковых смесей на альбумины и глобулины. Растворимость белков уменьшается также при добавлении дегидратирующих веществ (спирта, ацетона). [c.114]

Область применения. Концентрирование фракций, полученных при хроматографии, белков, выделенных другими методами фракционирования, биологических жидкостей и т. д. [c.221]

Ионообменная хроматография для фракционирования смеси белков используется значительно реже, чем для их очистки. Большие молекулярные массы обусловливают замедленную диффузию белков в жидких фазах и в связи с этим — невысокую разрешающую способность метода. Для смеси небольшого числа относительно некрупных белков ионообменное фракционирование еще себя оправдывает, однако в более сложных ситуациях оно явно уступает электрофорезу и изоэлектрофокусированию. Приведем несколько примеров фракционирования белков методом ионообменной хроматографии в более или менее благоприятных ситуациях. [c.309]

При очистке белков используют помимо указанных выше методов фракционирования также и ряд вспомогательных процедур. Особенно важны две из них —диализ и лиофилизация. Диализ, или удаление соли из раствора белка, заключается в пассивном переносе ионов из раствора белка через непроницаемую для белка мембрану в буферный раствор этот метод известен давно и применяется очень широко. Освобождение белка от соли путем диализа необходимо проводить на многих стадиях очистки, в частности после осаждения белка сульфатом аммония. Другой метод обессоливания — пропускание белкового раствора через соответствующие молекулярные сита. [c.81]

Разделение белков методом электрофореза на бумаге. В последнее время при исследовании белков, кроме фракционирования высаливанием, широко начали применять электрофоретическое разделение белкового комплекса, а также количественное определение отдельных фракций белков. Нередко электрофорез объединяют с хроматографией. В настоящее время есть множество приемов электрофоретического и хроматографического анализа белковых веществ, в связи с чем разработано много различных аппаратов для электрофоретического разделения белков. [c.44]

При помощи метода фракционирования гомогенатов органов и тканей в центрифугах было показано, что ядерная фракция печени и почек содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых белков. Основное место синтеза белка, как теперь установлено,— фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме [c.158]

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии высокой концентрации мочевины является одним из лучших методов фракционирования денатурированных или химически модифицированных белков. [c.207]

Электрофокусирование представляет собой миграцию молекул амфолита в градиенте pH под действием постоянного напряжения в область со значением pH, равным изоэлектрической точке вещества. Это явление известно довольно давно, однако до последнего времени все попытки применить его для фракционирования белков оставались в значительной мере безуспешными, главным образом из-за трудности создания удовлетворительного градиента pH. Эта задача была решена несколько лет назад благодаря применению синтетических амфолитов-носите-лей. В результате этого электрофокусирование прочно утвердилось как важный метод фракционирования белков. В 1967— 1968 гг. появилось описание метода примерно в 60 работах, что превысило число публикаций, посвященных предшествующим вариантам электрофокусирования, за последние 50 лет. [c.297]

Раствор, содержащий смесь двух и более веществ, отличающихся по размеру молекул, а следовательно, и по молекулярной массе, вносят в колонку, заполненную гелем с сетчатой структурой и уравновешенную буферным раствором. Наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты раствора, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы гелевой фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь геля, непрерывно обмениваются между жидкими фазами внутри и вне геля и продвигаются по колонке значительно медленнее. Находящиеся в растворе самые маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними. На этом принципе основаны методы фракционирования белков и других полимеров, их обессо-ливание, определение молекулярной массы, замена одних буферных растворов другими и др. [c.106]

При специфическом ферментативном гидролизе или химическом расщеплении любого белка среднего молекулярного веса получается довольно сложная смесь пептидов. Выделение и очистка всех пептидов, из которых состояла полипептидная цепь и которые содержатся в нефракционированном гидролизате, — задача достаточно трудная. Поэтому гидролизат белка рекомендуется сначала подвергнуть предварительному разделению. Среди современных методов фракционирования наиболее подходящим для этой цели является гель-фильтрация. [c.226]

Для фракционирования экстрагированных белков можно применять также осаждение сульфатом аммония. Жубер [58] выделил фракцию (11 12) S из подсолнечника осаждением сульфатом аммония при насыщении 22—30 % и фракцию альбумина при насыщении от 40 до 80 %. Симард и Буле [107] предложили метод фракционирования посредством фракционного растворения для белков сои, конских бобов и рапса. Метод состоит в осаждении сульфатом аммония при 90 %-ном насыщении суммарных белков, экстрагированных раствором (NH4j2S04 при 57,5 %-ном насыщении, а затем в последовательном экстрагировании из полученного осадка растворами сульфата аммония уменьшающихся концентраций. У конских бобов предпочтительные зоны растворимости фракций 7S и 11S соответственно 85—75 %-ного и 70—65 %-ного насыщения, а для глобулинов сои — соответственно 90—75 %-ного и 65—55 %-ного насыщения. Наконец, зона растворимости фракции 12S белков рапса располагается между 35 и 10 %, а зона растворимости фракции альбумина 2S распадается на две соответственно 60— 35 %-ного и 20—О %-ного насыщения. [c.153]

С помощью разнообразных методов фракционирования мембранные белки в солюбилизированной форме могут быть разделены и очи-шены до инднандуального состояния. Последующее удаление детергента в присутствии подходящих фосфолипидов позволяет реконструировать в искусственной мембране ту илн иную функцию изучаемого белка. В таблице 23 приведены структурные формулы н названия детергентов, наиболее часто используемых для солюбилизации и реконструкции мембран. [c.560]

Стремительное развитие биоорганической химии, физической химии полимеров и молекулярной биологии дало хроматографии новый объект исследований — высокомолекулярные соединения. Возникла необходимость в разделении синтетических полимеров и биополимеров, нуклеиновых кислот, белков, а также вирусов, фагов, рибосом и пр. Достигнутый в этом направлении успех позволил одному из крупнейших специалистов в области молекулярной биологии Френсису Крику сказать, что хроматография наряду с рентгеноструктурным анализом, электронной микроскопией и ультрацентрифугированием обеспечила все наиболее крупные успехи молекулярной биологии. Здесь следует особо выделить методы фракционирования биополимеров на ионообменных целлюлозах [2] и основанную на биоспецифической сорбции афинную хроматографию [3]. [c.10]

Наибольшее количество антител, образующихся в организме, содержится во фракции сывороточных "-глобулинов они могут присутствовать также и во фракциях р- и а-глобулинов. Для лечения и профилактики ряда заболеваний применяют сыворотки крови иммунизированных животных. Частично очищенные препараты иммунных глобулинов выделяют из сыворотки иммунизированных животных методами фракционирования белков. Чистые препараты антител могут быть получены путем избирательной ад- [c.112]

При высаливании белка нейтральными солями щелочных или щелочноземельных металлов, а также сернокислым аммонием необходимо применять высокие концентрации этих солей. Р а з л и ч н ы е б е л к и высаливаются при неодинаковых концентрациях соле й. Эгим обстоятельством пользуются для разделения белков на различные фракции. Так, для высаливания так называемых глобул и н о в (например, из сыворотки крови) достаточно прибавлять сернокислый аммоний до иолунасыщеиия. Отделив глобулины фильтрованием, можно оставшуюся в фильтрате так называемую альбуминовую фрак ц и ю осадить добавлением сернокислого аммония до полного насыщения. Методом фракционирования белков путем высаливания широко пользуются для получения различных белковых препаратов. [c.17]

Следует особо указать на различие между изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом. Спектр подвижности , создаваемый с помощью электрофореза, представляет собой картину распределения белков по величине молекул и суммарному заряду при данном значении pH. Существенное преимущество изоэлектрического фокусирования по сравнению с другими методами фракционирования состоит в том, что в ходе разделения зона белка сжимается, поскольку действующие силы стремятся уменьшить размывание зон вследствие диффузии. [c.299]

Грэйвланд и др. [83, 84] предложили новый метод фракционирования компонентов муки путем растворения белков в [c.179]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

В 1878 г. Хаммарстену удалось с помощью высаливания насыщенным сульфатом магния отделить глобулины от альбуминов сыворотки. Это открытие резко изменило существовавшее тогда представление о сывороточных белках. Применение сульфата магния положило начало целой серии методов фракционирования белков путем высаливания. В течение нескольких десятилетий процедура высаливания была единственно доступной как в клинических, так и в научных исследованиях белков крови. На этом этапе сывороточные белки крови были охарактеризованы по их растворимости в воде и в растворах солей разной концентрации. На основании этих данных стали различать нерастворимую в воде фракцию— эуглобулин и расгворшые — псевдоглобулин и альбумин. [c.8]

Способность кизельгура прочно сорбировать белки была использована В. С. Шапотом п сотрудниками, предложившими изящный метод фракционирования нуклеиновых кислот, входящих в состав клеточных нуклеонротеидов. Клетки гепатомы Зайделя, пометив предварительно в них РНК С- или Ш-уридином, а ДНК — Ш-ти-мпдпном, вскрывали детергентом, а гомогенат вносили на колонку, [c.245]

В последние годы в связи с развитием новейших методов фракционирования белков (хроматография на ионитах, препаративный электрофорез и т. п.) получены еще более активные препараты холинэстеразы сыворотки крови [83, 84]. Наибольшей активностью характеризуются препараты, полученные Янцем и Коэном [83] (уд. активность 10 /жг). По обычно принимаемым для белков критериям (кривые седиментации в ультрацентрифуге, электрофорез) эти препараты представляют собой индивидуальные белки с коэффициентом седиментации S o 9,9. [c.164]

Клеточный экстракт наряду с интересующим ферментом содержит п другие вещества белковой и небелковой природы. От них избавляются с помощью различных методов фракционирования. Последовательность их применения может быть различной, но целесообразно, в частности, учитывать специфику фермента. Например, если фермент термостабилен, следует, очевидно, начать с термической обработки, что даст возможность сразу же избавиться от большинства термолабиль-пых белков. Обычно белки неустойчивы в кислых растворах, поэтому если фермент выдерживает подкисление, его очистку следует начинать именно с этой стадии и т. д. [c.199]

В отношении белков бобовых культур хроматография гидрофобных взаимодействий используется мало. Наоборот, Рэймонд и др. [90] описывают метод фракционирования белков подсолнечника на октилсефарозе L-4B, который позволяет, помимо всего, удалять хлорогеновую кислоту из экстракта. [c.155]

Потребовалось выполнить исключительно большую экспериментальную работу по выбору п синтезу сорбентов и изучению условий проведения хроматографических процессов, прежде чем были созданы современные весьма изяш,ные хроматографические методы фракционирования макромолекул. Затруднения, возникшие при разработке этих методов, связаны прежде всего с необратимостью сорбции и малой емкостью сорбции белков. Период поисковых работ включал изучение распределительной хроматографии [1, 4] и молекулярной сорбционной хроматографии, в том числе весьма удачный для своего времени разработанный Тизелиусом метод хроматографии на фосфате кальция [2] и высаливающий хроматографический процесс [3], в котором емкость сорбции белков резко увеличивалась при высоких концентрациях электролита в растворе. Все эти методы, однако, уступили свое место высокоэффективной хроматографии белков на некоторых типах ионообменных смол, на модифицированных целлюлозах и методу гельфильтрации на сефадексах. Имеется значительное число обзоров по хроматографии белков, среди которых наиболее подробными являются статьи Циттла [4] и Мура и Штейна [5]. [c.188]

Из приведенных данных видно, что молекулы трипсина, а еще в большей мере химотрипсина, теряют способность проникать в зерно сорбента, что связано, естественно, с увеличением размеров макромолекул. У химотрипсина это происходит даже несмотря на образование трех осколков из каждой макромолекулы. Совершенно иначе ведет себя рибонуклеаза. Разрушение дйсульфид-ных мостиков и дальнейшее ацетамидирование приводят к увеличению проницаемости смолы этими макромолекулами, т. е. к уменьшению их размеров. Метод одноактной сорбции белков ионообменными смолами с целью анализа размеров макромолекул может быть сопоставлен с хроматографическим фракционированием белков методом гельфильтрации на сефадексе. Одноактная сорбция на ионитах и гельфильтрация на сефадексах приводят к идентичным суждениям об изменчивости морфологии белков после разрыва дисульфидных групп в трипсине, лизоциме и рибонук-леазе. [c.198]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология