С-концевые аминокислоты в белках и пептидах

Метод Эдмана последовательной деградации пептидов и белков основан на реакции фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой в щелочной среде, которая приводит сначала к образованию тиомочевинной метки концевой аминокислоты, последняя при действии СРзСООН отщепляется, в конечном счете, в виде замещенного фенилтиогидантоина, после чего полипептидная цепь белка укорачивается на один аминокислотный остаток. Далее этот процесс повторяется вновь [c.94]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Для определения М-концов пептидной цепи получают М-производ- ное концевой аминокислоты пептида, которое идентифицируют после полного гидролиза белка. [c.376]

Еше один метод определения N-концевой аминокислоты в белках и пептидах был предложен Шоу (1961). В этом методе используется кристаллический а-ацетил-р-этокси-Н-карбэтоксиакриламид II, получаемый присоединением уретана к дикетену с последующей реакцией образовавшегося N-ацетоацетилуретана I с ортомуравьиным эфиром и уксусным ангидридом. Реагент II в слабощелочном водном растворе быстро реагирует с пептидом, при этом образуется соответствующее 5-ацетилурацильное производное III. При последующем кислотном гидролизе получается смесь аминокислот и замещенный урацил IV из концевой аминокислоты. [c.692]

Аналогичным способом к дипептиду могут присоединяться и другие аминокислоты с образованием три-, тетра-, пентапептида и т.д. вплоть до крупной молекулы полипептида (белка). Наименование пептидов складывается из названия первой К-концевой аминокислоты со свободной КН,-группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из 5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием глицил-аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли-Ала-Сер-Цис-Ала . [c.50]

Определение С-концевых остатков в пептидах и белках разработано менее удовлетворительно, нежели определение iV-концевых. Предлагались многочисленные химические методы, но ни один из них не выдержал проверку временем. К счастью, с помощью двух панкреатических ферментов — карбоксипептидазы А и карбокси-пептидазы-В — можно получить некоторую информацию о С-кон-цевой последовательности. Карбоксипептидаза А преимущественно отщепляет аминокислоты с ароматическими боковыми группами, а большинство остальных аминокислот отщепляет гораздо медленнее. С-концевой Pro устойчив. Этот фермент хорош при идентификации С-концевых последовательностей у пептидов, образующихся в результате расщепления с помощью а-химотрипсина (см. разд. 23.3.6), так как такие пептиды на С-конце имеют ароматические аминокислоты. При обработке пептида или белка карбокси-пептидазой А возникают те же трудности, что и при использовании аминопептидаз для анализа iV-концевых последовательностей (см. разд. 23.3.4.1). Карбоксипептидаза В гораздо более специфич- [c.272]

Аналогичные превращения протекают в реакциях свободных аминогрупп концевых аминокислот в пептидах и белках, например, с 2,4-динитрофторбензолом при гидролизе пептидных связей 8] образующиеся динитрофениловые кислоты можно идентифицировать. О методах определения концевых групп см. раздел 2.3.2.2. [c.239]

Одним из средств, которые дали возможность Зангеру решить головоломку, был метод метки концевой аминокислоты в пептиде. Возьмем, например, обломок белка — пептид, состоящий из трех аминокислот. При гидролизе он дает аминокислоты А, В я С. Возникает вопрос Какова последовательность их расположения в пептиде Первое звено трехчленной цепи должно иметь свободную (несвязанную) аминогруппу (КНз). Зангеру удалось найти химическую метку, которую можно было присоединить к этому концу цепочки и которая не отделялась от аминокислоты после гидролиза пептида. Эта метка — динитрофенильная (ДНФ-) группа. Она придает аминокислоте, к которой она прикреплена, яркий желтый цвет. Анализ положения аминокислот в трипептиде производится следующим образом. Трипептид обрабатывают веществом, содержащим метку, и затем расщепляют на три составляющие его аминокислоты. Аминокислоту, которая занимает концевое положение, скажем В, можно теперь узнать по ее желтой окраске. Затем процесс повторяют вновь, со второй порцией трипептида. Однако на этот раз его гидролизуют только частично, так чтобы осталось две аминокислоты в виде окрашенного в желтый цвет дипептида. Если в этом обломке В связана, скажем, с А, то очевидно, что последовательность в дипептиде должна быть ВА, а в исходном трипептиде — ВАС. [c.95]

Для определения С-концевых аминокислот в белках и пептидах используют как химические, так и ферментативные методы. [c.154]

Недостатки метода включают неустойчивость ДНФ-производных к действию света и ограничения в применении метода для изучения последовательности при определении М-концевых аминокислот в пептидах, освобождающихся при частичном гидролизе белков или высокомолекулярных пептидов. Хотя эта методика была успешно применена при определении последовательности аминокислот в инсулине, она громоздка и слишком трудоемка в случае длинных полипептидных цепей. [c.153]

Замечательные успехи в синтезе белков, достигнутые в последние годы, стали возможны после того, как Меррифилдом был разработан метод синтеза на твердом носителе. Принцип метода состоит в том, что исходная С-концевая аминокислота связывается ковалентно с нерастворимым полимером пространственной структуры и затем все последовательные стадии синтеза пептидной цепи проводятся на этом носителе. При этом отпадает необходимость выделения на каждой стадии синтеза полученных пептидов, так как они остаются привязанными к носителю, и становится возможным простой промывкой носителя удалять побочные продукты синтеза и непрореагировавшие исходные вещества. [c.381]

С-КОНЦЕВЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ В БЕЛКАХ И ПЕПТИДАХ [c.154]

К. используют для определения последовательности С-концевых аминокислот в белках и пептидах. [c.322]

Методы определения С-концевых аминокислот пептидов и белков менее разработаны. Следует остановиться на трех способах. [c.513]

По размеру молекулы и своим свойствам пептиды стоят между высокомолекулярными белками и аминокислотами. Наиболее распространены линейные пептиды, однако известны также циклические пептиды, молекулы которых могут иметь различные размеры. Циклические пептиды образуются из линейных, когда пептидная связь связывает амино- и карбоксильную функцию К- и С-концевых аминокислот. [c.83]

В природных белках сравнительно мало титруемых свободных СООН- и КН,-групп, поскольку абсолютное их большинство находится в связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей титрованию доступны в основном свободные СООН- и КН -группы у К- и С-концевых аминокислот пептида. [c.50]

Определение. 0,5—1 мкмоль белка растворяют в 10—20 мл воды и осаждают на холоде, добавляя трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%- Осадок промывают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, а затем 3—4 раза ацетоном для удаления ее следов. Указанные стадии позволяют удалить свободные аминокислоты, которые могут загрязнять препарат белка, и приводят к денатурации белка, повыщающей доступность С-концевых аминокислот к действию карбоксипептидаз. При определении С-концевых аминокислот в пептидах первые стадии необходимо опустить. Промытый осадок белка или пептид растворяют в 0,2 М аммоний-бикарбонатном буфере или в [c.155]

Основная область научных исследований — химия белка. Разработал (1920—1930) методы получения пептидов, в частности ами-нолизом азлактонов аминокислотами или их эфирами (реакция Бергманна). Открыл (1926) реакцию циклизации К-галогенацил-аминокислот с одновременным де-галогенированием при нагревании с уксусным ангидридом в пиридине с образованием азлакюнов (реакция Бергманна). Установил (1928) способность натрия и лития присоединяться к многоядерным ароматическим углеводородам. Совместно с Л. Зервасом предложил (1932—1936) способы получения исходных производных аминокислот, в частности способ создания К-карбоксипроизводных. Провел цикл исследований, посвященных протеолитическим ферментам и положенных в основу современной классификации последних. Открыл (1934) реакцию определения С-концевой аминокислоты в пептидах через соответствующие альдегиды, полученные превращением пептида в азид, затем в карбобенз-оксипроизводное с последующими гидрированием и гидролизом (карбобензокси-метод, или реакция Бергманна). Издал труды Э. Г. Фи- [c.50]

В последнее время более предпочтительно для определения Н-концевых аминокислот в пептидах и белках получать сульфамидные производные, так называемые дансиламинокислоты, действием диметиламинонафталин-8-сульфонилхлорида. Они хорошо флуоресцируют, довольно стабильны при кислотном гидролизе и могут быть определены с большей чувствительностью, чем динитрофенильные производные [406, 422, 585]. [c.101]

Этот пептидный остов — структура, свойственная всем белкам. В каждом пептиде один из двух концевых аминокислотных остатков имеет свободную а-аминог-руппу (N-концевая аминокислота), а другой — свободную а-кар бокс ильную группу (С-концевая аминокислота). Структуру пептидов принято изображать, начиная с N-концевой аминокислоты с нее же начинается нумерация аминокислотных остатков. При этом аминокислотные остатки обозначаются символами. Например [c.21]

Ряд методов определения Ы-концевых аминокислот основан на алкилировании или ацилировании пептида и последующем гидролизе. В гидролизате концевая аминокислота обнаруживается в виде алкильного или ацильного производного. Наиболее важным и детально разработанным методом является метод динитрофенилирования белка, предложенный в 1945 г. Зангером и использованный им при установлении строения инсулина. [c.510]

Химические методы основаны главным образом на модификации С-концевых аминокислот. После полного гидролизаполипептидной цепи эти производные отделяют от немодифицированных остатков и идентифицируют. К химической группе методов относятся гидразинолиз, отщепление С-концевых аминокислот под действием изотиоцианата аммония и восстановление этерифицированных белков и пептидов алюмогидридом лития. [c.154]

При обработке белка или пептида безводным гидразином при нагревании (100°С) происходит гидролиз полипептидной цепи. При этом все аминокислоты, за исключением С-концевой, превращаются в гид-разиды, а С-концевая аминокислота остается свободной [c.156]

Следующей задачей при определении строения пептидов является установление характера связи и последовательности аминокислотных остатков в молекуле пептида или белка. Эта задача, трудно выполнимая в настоящее время для белков с большим молекулярным весом, облегчается тем, что в природе встречается значительное число относительно низкомолекулярных соединений, представляющих собою пептиды. Виланд предлагает различать три группы природных пептидов олигопептиды, состоящие из 2—10 аминокис/ют, полипептиды, состоящие из 10—100 аминокислот, и макропептиды, к которым относятся собственно белки. Изучение природных пептидов представляет собой важный этап в подходе к изучению строения белка. Исследование обычно начинают с определения числа цепей, входящих в состав объекта изучения. Для этого пользуются одним из ранее приведенных методов, например диннтрофенилированием, действием азотистой кислогы или аминопептидазы для определения Н-концевой аминокислоты и восстановлением, гидразинолизом или действием карбоксипептидазы для определения С-концевого остатка (см. стр. 510 и далее). [c.514]

Одним из самых ценных реагентов при работе с белками является фенилизотиоцианат, впервые примененный П. Эдманом. Это соединение реагирует с хМ-концевой аминогруппой пептидов [уравнение (2-25)]. Образующийся продукт циклизуется, что в кислой среде влечет за собой разрыв пептидной цепи (2-25). В итоге образуется соответствующий Ы-концевой аминокислоте фенилтиогидантоин, который можно идентифицировать. Проделав ту же операцию с укороченной указанным путем пептидной цепью, можно определить следующий аминокислотный остаток. При тщательной постановке эксперимента с помощью реакции Эдмана можно пройти вдоль пептидной цепи несколько десятков остатков. Есть специальные приборы — так называемые секвена-торы, в которых все необходимые операции осуществляются автоматически. [c.174]

Используя технику клонирования ДНК [599] и анализа нуклеотидных последовательностей [600], Наканнши и сотр. foOl] установили нуклеотидную последовательность мРНК-предшественника. Нумерация аминокислотной последовательности положительная справа от N-концевой аминокислоты АКТГ, в левую сторону отсчет идет со знаком минус. Белок-предшественник содержит 8 пар основных аминокислот и одну двойную пару -Lys-Lys-Arg-Arg. В этих местах происходит ферментативное расщепление белка с образованием различных пептидов. /3-Липотропин образует С-концевую область и, вероятно, отщепляется непосредственно от предшественника. Общая схема ферментативного расщепления и вид фрагментации к настоящему времени еще не установлены. В отличие от известных последовательностей /3-липотропинов свиньи и овцы /3-липотропин теленка содержит между 35 и 36 аминокислотными остатками два дополнительных (-Ala-Glu-) этим объясняются различные длины цепей липотропинов (см. схему). Анализ на ЭВМ аминокислотной последовательности отрицательной части предшественника дал интересный результат между позициями —55 и —44 найдена аминокислотная последовательность -Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-, имеющая большое сходство с а- н /3-МСГ. Так как в области аминокислотной последовательности предшественника от —111 до —105 присутствует еще один участок, имеющий структурное сходство с МСГ-пептидами, предполагается существование серии дупликаций гена, аналогично имеющей место в случае иммуноглобулинов. О [c.242]

В настоящем разделе рассматриваются только те методы, которые обеспечивают ступенчатое отщепление аминокислотных остатков, так что пептидная цепь после отщепления концевого остатка остается незатронутой. Таким образом, из рассмотрения исключается 2,4-динитрофторбензольный метод, предложенный Сэнджером [262]. Этот метод, использовавшийся для получения большей части сведений о М-конце-вых группах пептидов и белков, подробно рассмотрен в ряде обзоров [114, 277, 320]. Не рассматривается также метод расщепления гидразином Ака бори и сотр. [3, 4, 230], позволяющий определять С-концевые аминокислоты. Этот метод в последнее время был усовершенствован [39], так что он стал пригоден для идентификации всех обычно встречающихся аминокислот. [c.238]

Другой метод, основанный на использовании безводной трифторуксусной кислоты [100], которая очень хорошо растворяет белки [173], успешно применялся для циклизации (5 мин при 0°) ФТК-производных при последовательном расщеплении в пепсине участка Н.Илей.Глу.Асп.Глу— [90]. Этот метод можно применять также для обработки ФТК-производных других белков. Вследствие быстрого образования промежуточного реакционноспособного тиазолинона (см. схему на стр. 239), по-видимому, это соединение лучше экстрагировать после кратковременного проведения реакции и завершить циклизацию в Зн. НС1, которая не разрушает ФТГ-производных серина и треонина. Представляет интерес тот факт, что очень низкие выходы, полученные Шефердом и сотр. [284] при тщательном изучении расщепления пептидов из кортикотропина, обусловлены потерями (50—70%) на стадии циклизаций в среде ледяная уксусная кислота — НС1 при 75—80° в течение 15 мин. Поскольку тиазолинон образуется быстро и имеет высокую реакционную способность, подобные условия циклизации являются, по-видимому, рлишком жесткими. На основании экспериментальных результатов этих авторов можно предположить, что критическая фаза разложения наблюдается во время расщепления и циклизации или одного из этих процессов, так как в более мягких условиях выход аминокислот при регенерации из ФТК-пептидов оказался ниже, чем выход аминокислоты из ФТГ-производного аланина в аналогичных условиях. Этим можно объяснить, почему некоторые исследователи [108, 151, 242] предпочитают пользоваться методом вычитания, согласно которому N-концевая аминокислота обнаруживается по ее исчезновению. Несмотря на низкие выходы и случайное расщепление связей, Шеферду и сотр. [284] удалось обнаружить N-концевой остаток, так как его количество обычно в 5—10 раз превышает содержание других аминокислот а реакционной смеси. Однако в случае неустойчивой, неэкстрагируемой или встречающейся в пеп [c.244]

Один нз методов идентификации Л -концевой аминокислоты пептида нли белка состоит в замещении -аминогруппы иа такую груп-. пу, которая выдерживает гидролиз, и таким образом, после кислотного нлн ферментативного гидролиза меченую аминокислоту можно обнаружить спектрофотометрнчески, спектрофлуорометри-чески илн по радиоактивности и идентифицировать с помощью хроматографии. [c.264]

Под действием иротеолитических ферментов (иротеиназ) белки расщепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности действия иротеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидролиза доказана последующим химическим их синтезом. [c.51]

МИД (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка СКВг предпочтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов, первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных ранее методов, всякий раз начиная с определения природы К- и С-концевых аминокислот. [c.56]

Смотреть страницы где упоминается термин С-концевые аминокислоты в белках и пептидах: [c.58] [c.386] [c.69] [c.495] [c.479] [c.402] [c.345] [c.384] [c.385] [c.385] [c.713] [c.249] [c.142] [c.145] [c.217] [c.371] [c.338] [c.39] [c.265]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология