Соотношение фермент — субстрат

Соотношение фермент — субстрат [c.600]

Пепсин обладает очень широкой специфичностью. Хотя в опытах с синтетическими субстратами преимущественно расщеплялись связи, образованные аминогруппами ароматических аминокислот, имеется много примеров, когда такие связи в белках устойчивы к действию пепсина. Атаке подвергаются только пептидные связи амиды и сложные эфиры не расщепляются. Специфичность пепсина повышается при уменьшении количественного соотношения фермент/субстрат и при ограничении времени реакции до 30 [78]. [c.125]

Методика. Примерно 0,1 мг полипептидного субстрата высушивают на дне конической центрифужной пробирки, наливают в пробирку 85 мкл реактива 1 и 5 мкл реактива 3, доводя тем самым концентрацию меркаптоэтанола на период ферментативного гидролиза до 0,02 М. Затем к забуференному субстрату добавляют 10 мкл реактива 2 (5 мкг папаина), обеспечивая концентрацию папаина 50 мкг на 1 мл (весовое соотношение фермент субстрат 1 20) в объеме 100 мкл. Смесь инкубируют 2 час при 37°, затем инактивируют папаин 2 каплями уксусной кислоты, а раствор лиофилизуют. Вследствие небольшого объема раствора процесс лиофилизации заканчивается за 30—60 мин. [c.126]

Подбор оптимальных условий гидролиза осуществляют, варьируя четыре основных параметра состав буфера, соотношение фермент субстрат, температуру и время. Конкретные условия, в которых следует проводить гидролиз данным ферментом, при- [c.139]

Обычно ферментативный гидролиз проходит количественно при соотношении фермент субстрат=1 50- 100. Если требуется ограничить степень гидролиза, то соотношение увеличивают (до 1 1000). В то же время в некоторых случаях для достижения полноты гидролиза соотношение приходится уменьшать (до 1 10). [c.140]

М цитрате натрия или ацетате пиридина (pH 5,5) при соотношении фермент субстрат = 0,1- 1,0% (по массе). Карбоксипептидаза У иногда не отщепляет Asp или основные аминокислоты [34]. [c.511]

Условия гидролиза. Клострипаин проявляет максимум активности при pH 7,7 в присутствии сульфгидрильных реагентов [68]. Целесообразно проводить гидролиз в присутствии ионов Са +, хотя их присутствие не обязательно. Гидролиз проводят при соотношении фермент субстрат = 1 50 в 100 мМ NH4H O3 и 1 мМ дитиотреите при 25 °С в течение 4 ч. Рекомендуется [c.152]

Примером наиболее полного расщепления белковой цепи при действии лейцинаминопептидазы является гидролиз меркурипапаина. При низких концентрациях фермента первые девятнадцать аминокислотных остатков отщепляются за 24 час в примерно стехиометрических количествах. Реакция, по-видимому, прекращается тогда, когда остаток аргинина становится Й-концевым. При более высоких соотношениях фермент/субстрат расщепление происходит в большей степени, пока 2/з белка не расщепится До свободных аминокислот. Белковый остаток после активации полностью сохраняет активность (в расчете на 1 моль) по отношению к бензоил арг инил амиду. Это свидетельствует о том, что активный центр молекулы находится на С-концевом участке цепи. [c.237]

Гидролиз протекает в слабощелочной среде при pH не выше 8,5 и температуре 45° С соотношение фермент — субстрат 1 50. Для предотвращения бактериального заражения в раствор добавляют 2% этанола. Сдержание серебра в шламе достигает 45%. Процесс характеризуется высокой степенью извлечения серебра, возможностью вторичного использования основы, на которую была нанесена фотоэмульсия, а также тем, что маточный раствор, представляющий собой смесь аминокислот, в дальнейшем может служить источником сырья для фармацевтической промышленнности. [c.145]

Частично лиофилизованную смесь растворяют в 80 мкл реактива 4 и 5 мкл реактива 3, добавляют к раствору 15 мкл реактива 5 (150 мкг АПМ) и тем самым доводят концентрацию АПМ до 1,5 мг на 1 мл (весовое соотношение фермент субстрат 1,5 1) з объеме 100 мкл. Инкубирование с АПМ ведут 3 час, понижают pH среды добавлением уксусной кислоты и смесь лиофилизуют. После этого остаток можно растворить в соответствуюшем объеме того буфера, который используют для введения образца в колонку аминокислотного анализатора. [c.126]

Использование экзогенных ферментов для удаления РНК хотя и эффективно, но менее оправдано, так как требует введения дорогостоящих препаратов. Кроме того, необходима предварительная дезинтеграция биомассы для облегчения проникновения экзогенной РНК в клетки. С помощью панкреатической рибонуклеазы удалось снизить содержание нуклеиновых кислот в дезинтеграте дрожжей до 1,0—1,5% за 1 ч при температуре 30—37°С, pH 7,0—7,5, соотношении фермент — субстрат 1 500, концентрации суспензии дезинтеграта 16—20% [Рогожин и др., 1976]. [c.87]

Условия гидролиза. Гидролиз проводят в 1% NH4H O3 pH 8,0) при 37 С в течение различных периодов времени (до 24 ч) при соотношении фермент субстрат= 1 50. Гидролиз останавливают подкислением НС] до pH 1,5—2,0 [88]. [c.153]

Условия гидролиза. Гидролиз проводят в 0,2 М N-этилмор-фолин — ацетатном буфере (pH 8,0) при соотношении фермент субстрат=1 100 при 35 С в течение 22 ч [15] или в 0,1 М NH4H O3 при соотношение фермент субстрат= 1 500 1000 при 37 X [36]. Удовлетворительные результаты получены при проведении реакции в диапазоне pH 4—9 и при повышении температуры до 50 °С. Оптимальные результаты получены при обработке субстратов в 10 мМ трис — H l-буфере (pH 7,0), содержащем 0,15 М Na l и 2 мМ ацетат кальция, при соотношении фермент субстрат= 1 100 при 37 °С в течение 3 ч [44]. Фермент ингибируется в присутствии ЭДТА, а также 1 мМ раствором лизина или цистеина [111]. [c.154]

Условия гидролиза. Фермент из Myxoba ter проявляет максимум активности при pH 8,5—9,0, характеризуется устойчивостью к автолизу, термостабильностью при 60 °С и ингибируется в присутствии 50 мМ ЭДТА [117]. Гидролиз проводят в 20 мМ трис-НС1-буфере (pH 9,0) при 37 °С в течение 4 ч при соотношении фермент субстрат= 1 100 [49]. [c.155]

Условия гидролиза. Гидролиз проводят в условиях, аналогичных гидролизу трипсином в 100 мМ NH4H O3, соотношение фермент субстрат= 1 50, 37 °С, 4 ч. Иногда используют буфер [c.156]

Условия гидролиза. Термолизин проявляет активность в диапазоне pH 7,0—8,0, требует присутствия ионов Са . Гидролиз проводят в 100 мМ NH4H O3, содержащем 5 мМ СаСЬ. Большинство препаратов фермента содержит значительное количество Са +, которого в принципе достаточно для проявления ферментативной активности. Фермент ингибируется в присутствии ЭДТА. Обработка белков при 37 °С в течение 4 ч при соотношении фермент субстрат=1 50 позволяет получить удовлетворительные результаты, хотя иногда требуется провести дополнительные исследования для подбора оптимальных условий. Термолизин термостабилен, сохраняет 1007о активности при инкубации при 60 °С в течение 1 ч и значительную часть — при 80 С [65]. Фермент устойчив в 8 М мочевине, а также [c.157]

Условия гидролиза. Папаин проявляет максимум активности в диапазоне pH 5—7,5, причем активацию фермента проводят в присутствии сульфгидрильных реагентов. Гидролиз проводят в 0,2 М пиридин-ацетатном буфере (pH 6,5), содержащем 1% (по объему) 2,3-димеркаптопропан-1-ола, в течение 1 ч при 37 X и соотношении фермент субстрат—I 50 (по объему) [84]. Папаин легко инактивируется при окислении в присутствии низких концентраций цистеина, солями тяжелых металлов или цианат-ионами [97]. Папаин устойчив в присутствии мочевины, причем активность сохраняется даже в 8 М растворе мочевины, од11ако раствор последней должен быть тщательно деионизирован, чтобы исключить инактивирующее действие цианат-ионов. [c.159]

Условия реакции. Гидро. тиз проводят в условиях, аналогичных трипсину и химотрипсину, т. е. в 100 мМ NH4H O3 при 37 °С в течение 1—4 ч при соотношении фермент субстрат [c.159]

Согласно методике Спакмена и сотр. [41], впервые использованной при изучении рибонуклеазы А, 0,17о-ный раствор белка в 0,05 М Ыа-цитратном буфере (pH 1,0) инкубируют с пепсином при соотношении фермент субстрат 1 50 при 25 °С в течение 16 ч. Последующие модификации методики включают увеличение концентрации фермента, проведение инкубации при 37 °С, уменьшение времени гидролиза, применение других растворителей, например 5%-ной муравьиной кислоты и 0,03 М НС1 [30, 34, 42, 43]. Гидролиз останавливают замораживанием, в случае необходимости раствор лиофилизируют. Полезную информацию можно найти в разд. 3.6.3. [c.170]

При последовательном расщеплении человеческого -тромбо-глобулина бромоцианом в 707о-ной муравьиной кислоте и стафилококковой протеазой при pH 4,0 получены цистинсодержа-щие пептиды, по структуре которых определено положение двух дисульфидных связей [3]. Белок, обработанный бромоцианом (20 мг/мл), инкубировали с ферментом (при соотношении фермент субстрат= 1 40) в 0,05 М аммонийноацетатном буфере при pH 4,0 при 37 °С в течение 18 ч. См. также разд. 3.5.3. [c.171]

Сукцинилирование [9]. К 1%-ному раствору белка в 1,0 М Na-бикapбoнaтнoм буфере (pH 8,0) при 25 С постепенно в течение 1 ч добавляют 0,8 части (по массе) янтарного ангидрида. pH 8,0 реакционной смеси поддерживают путем добавления 0,1 М ЫаОН. Через 1—2 ч реакционную смесь разбавляют 2,5 объема дистиллированной воды и диализуют в течение 12 ч. Модификацию некоторых белков вполне возможно проводить в более мягких условиях [22]. Затем модифицированный белок может быть инкубирован одновременно в присутствии трипсина, химотрипсина и термолизина при соотношении фермент субстрат= 1 50, Условия инкубации 0,1 М К-фосфатный буфер (pH 6,8), 40 °С. Спустя 4 ч раствор подкисляют до pH 3,0 и высушивают лиофильно. [c.172]

АМ.2, Малеилирование [5]. С помощью частичного малеилирования устойчивому к протеолизу белку можно придать чувствительность к действию трипсина. Реакцию проводят при 10-кратном избытке малеинового ангидрида (на каждую аминогруппу) при pH 8,0 в течение 5 ч. Затем доводят pH смеси до 7,0 и инкубируют модифицированный белок с трипсином при 37 °С и при соотношении фермент субстрат= 1 33. Реакцию останавливают путем подкисления до pH 3,0. Снятие защитных групп проводят при pH 3,5, 37 °С в течение 48 ч [7]. Смесь пептидов может быть подвергнута дальнейшему гидролизу трипсином или другими протеазами. [c.172]

В идеальном случае в результате протеолитического расщепления каждый участок полипептидной цепи будет представлен в гидролизате одним единственным пептидом, образовавшимся с максимально возможным выходом. Реально такое положение не достигается, поскольку каждая протеаза в отдельных участках полипептидной цепи проявляет различную степень сродства и гидролизует связи с различной скоростью. Однако можно ограничить процесс протеолиза точками наибольшего сродства. В общем случае это достигается путем уменьше1шя соотношения фермент субстрат или путем увеличения объема добавленного буферного раствора сокращение времени гидролиза также приводит к увеличению выхода фрагментов, образующихся в результате быстрого расщепления по наиболее актив 1ым точ- [c.349]

Ферментативное расщепление. Термолитическое расщепление проводят в 1%-ном водном бикарбонате аммония при 37 °С в течение 8 ч при соотношении фермент субстрат=-1 35 (по массе). Для прерывания расщепления реакционную смесь лиофилизуют. [c.486]

Если в ходе предварительного эксперимента обнаруживается высвобождение многих аминокислот, то следует использовать низкое отношение фермент субстрат (1 100 или 1 200) или проводить отщепление при комнатной температуре. Если аминокислоты высвобождаются медленно, т6 в последующем опыте используют высокое соотношение фермент субстрат (1 20). Если в предварительном опыте с карбоксипептидазами А и В не обнаружено значительных количеств свободных аминокислот, то следует применить методы С-концсвого химического анализа или выделить С-концевой пептид и пО результатам этих опытов судить о причинах неудач с расщеплением белка при помощи карбоксипептидаз. [c.509]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология