Получение первых препаратов ферментов

Крупные открытия в науке обычно делаются при разработке фундаментальных проблем. Мы разделяем мнение большинства врачей о том, что последние достижения биотехнологии, нашедшие применение в самых важных отраслях медицины, оказывают и будут оказывать революционизирующее воздействие на диагностику, лечение и понимание основ патологии многих тяжелых заболеваний. Ориентируясь на читателей, не имеющих медицинской подготовки, мы расскажем о том, какую важную роль играют в клинической практике некоторые новые подходы, а также широко используемые методы диагностики. Мы по необходимости ограничимся лишь немногими примерами, но читатель может без труда дополнить их множеством других использованием в терапии белков, которые можно синтезировать при помощи видоизмененных методами генетической инженерии микроорганизмов, применением моноклональных антител, ферментов и т. д. Мы не обсуждаем использующиеся при этом технологические процессы сколько-нибудь подробно (о них речь идет в других главах) исключение составляет лишь раздел о синтезе инсулина человека дело в том, что инсулин был первым белком, полученным с помощью технологии рекомбинантных ДНК и испытанным на людях, а также первым или одним из первых) препаратом такого рода, нашедшим применение в клинике. [c.325]

Рассматривая главные области использования ферментов, уже сейчас можно отметить те из них, которые первыми потребуют более очищенных препаратов. Это, в первую очередь, пищевая промышленность, где высокая очистка ферментов, уменьшение количества примесей связаны почти всегда с повышением качества продукции далее — медицина и медицинская промышленность, где кристаллические и иные высокоочищенные препараты ферментов широко используются уже сейчас и, наконец, химия и химическая промышленность, где избирательность и чистота катализатора определяют очень многие возможности и, в частности, проведение реакций только в необходимом направлении и получение чистых конечных продуктов. По-видимому, несколько позднее препараты высокой очистки станут необходимыми в общественном питании, хотя эта область в целом близка к пищевой промышленности в легкой промышленности и, наконец, в коммунальном и сельском хозяйстве. Так или иначе, но направлять развитие производства ферментов на получение все более чистых препаратов целесообразно заранее, непосредственно сейчас. [c.212]

Получение первых препаратов Ферментов [c.116]

Во-первых, оказалось, что при получении кристаллических препаратов ферментов с ними оказывается связанной практически вся активность препарата при этом было отмечено, что выход кристаллов был тем больше, чем больше фермента содержал исходный материал. [c.156]

Однако второй путь — получение выделенных, очишенных ферментных препаратов и при их помощи коренное усовершенствование разнообразных технологических схем — является несравненно более эффективным, чем первый, и перспективным. Акад. А. И. Опарин, отмечая это, указывает, что создание ферментной промышленности явится новой ступенью в управлении биохимическими процессами, протекающими при переработке пищевого сырья. Использование очищенных препаратов ферментов позволяет более точно регламентировать весь ход производственного процесса, изменять его в желаемом направлении, получать продукцию, постоянную по своим свойствам, необходимого качества и т. д. [c.5]

Таковы были первые заключения о природе ферментов, полученные при изучении первых препаратов биокатализаторов. [c.125]

В настоящее время находят применение некоторые протеазы, полученные из экстрактов животного, растительного и микробного происхождения. В первом случае речь идет преимущественно о пепсине, трипсине, химотрипсине (особенно а-химо-трипсин) из протеаз растительного происхождения наиболее употребимы папаин и фицин. Среди многочисленных ферментов микробного происхождения имеются препараты промышленного назначения бактериальные экстракты, дрожжи, плесневые грибы. Эти ферменты поступают в торговлю под различными названиями, и их специфическая активность не всегда хорошо известна, особенно когда речь идет о препаратах или смесях ферментов. Впрочем, сходная картина наблюдается и в отноше- [c.598]

Первыми ферментами полученными в кристаллическом виде, были уреаза (выделенная в 1926 г. Самнером) и пепсин (выделенный Нортропом в 1929 г.). Самнер и Нортроп получали ферменты в кристаллическом состоянии путем высаживания их из растворов сульфатом аммония, спиртом, ацетоном и другими химическими реагентами. В последние годы благодаря использованию новых эффективных методов очистки ферментов (электрофорез, ионообменная хроматография, противоточное распределение, гель-фильтрация) и модернизации уже известных методов их выделения и очистки удалось получить сотни химически однородных кристаллических препаратов ферментов. [c.199]

Очищенные препараты рестриктаз необходимы как для их характеристики, так и для использования в качестве аналитических реагентов в различных сферах применения этих ферментов. Выделение рестриктаз, как и любых других ферментов, преследует две цели — получение ферментных препаратов, свободных от нежелательных примесных активностей (функциональная чистота), или получение гомогенных белков (физическая чистота). В случае специфических эндонуклеаз в качестве нежелательных примесей в первую очередь выступают неспецифические нуклеазы и фосфатазы, имеющиеся во всех клетках, а иногда и рестриктазы, присутствующие наряду с целевым ферментом в биомассе некоторых продуцентов. [c.141]

В 1814 г. член Петербургской Академии наук К. С. Кирхгоф обнаружил, что вытяжка из солода вызывает превращение крахмала в более простые сахара. Иначе говоря, впервые был получен препарат фермента в виде раствора, а не в составе живых клеток. В 1897 г. немецкий ученый Э. Бухнер прессованием растертых дрожжей получил сок, который также не содержал клеток, но был способен вызывать спиртовое брожение. Такого рода опыты утвердили представление о том, что в живых клетках содержатся вещества, катализирующие определенные реакции, и что эти вещества можно выделять из клеток и изучать методами химии. В 30-х годах XX в. некоторые ферменты были получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии. По химической природе кристаллы оказались белковыми, и это послужило первым надежным доказательством того, что ферменты представляют собой белки. [c.61]

Изучение большого числа протекающих в митохондриях процессов может быть успешно проведено как с изолированными органеллами в качестве источника фермента, так и с высокоочищенными препаратами соответствующих митохондриальных ферментов. Однако второй подход практически неприемлем для изучения реакций, непосредственно сопряженных с функционированием системы трансформации энергии в митохондриях. В первую очередь это относится к процессу окислительного фосфорилирования, который с высокой эффективностью протекает и может быть изучен либо в изолированных (интактных) митохондриях, либо в специальным образом полученных препаратах субмитохондриальных частиц. В этом случае также важно убедиться в том, что скорость изучаемой реакции линейно зависит от концентрации катализатора (от концентрации общего белка митохондрий или субмитохондриальных частиц). Измерение скорости окислительного фосфорилирования и термодинамической эффективности (отношение АДФ/О) традиционно проводится и предшествует изучению любых митохондриальных функций. [c.465]

На основе использования иммобилизованных ферментов в настоящее время разработаны некоторые принципиально новые промышленные методы получения веществ. Речь в первую очередь идет о синтезе новых лекарственных препаратов. [c.200]

Интересно отметить, что эти работы, так же как и первые попытки исследовать свойство индивидуальных ферментных препаратов, были встречены критикой ряда видных биохимиков. При этом снова было выдвинуто возражение, что нарушение целостности живой клетки настолько нарушает условия ее жизнедеятельности, что ни о какой правильной интерпретации полученных результатов не может быть и речи. Высказывались сомнения в возможности получать кристаллические ферментные препараты. Предполагалось, что это лишь кристаллы белка, на которых адсорбированы низкомолекулярные активные ферменты, природа которых еще не известна. Однако после того, как Норт-роп привел убедительные доказательства, что именно выделенные им белковые препараты обладают ферментативной активностью, была признана белковая природа ферментов. Все выделенные с тех пор ферменты оказались белками. [c.173]

В настоящее время во всех реестрах и справочниках лекарственных средств самостоятельно выделяются лекарственные средства, объединенные в фармакотерапевтическую группу "Ферменты ". Название фермент происходит от латинского слова " ГегтеШит" - закваска, что ассоциируется с природой процессов брожения, которые первыми в мире показал известный французский ученый Луи Пастер еще в 1856 году Чуть позже, в 1864 году, российский академик Кирхгоф доказал целевое получение жидкого препарата ячменного солода. Это официальные вехи истории общепризнанной, в настоящее время активно развивающейся науки энзимологии. В то же время истоки можно обнаружить в глубинах веков, когда человек, используя известные ему растения, продукты жизнедеятельности и органы насекомых и животных, освоил в нащем понимании технологии получения сыра, хлеба, вина, пива, уксуса, других пищевых продуктов. [c.201]

Сравнительный анализ сухого экстракта, полученного из плодов шиповника обычным способом, и после ферментной обработки сырья или водного экстракта, показал, что содержание витамина С в первом способе значительно ниже чем в остальных, в которых даже при переработке некондиционного сырья получается сухой экстракт шиповника с содержанием витамина С 7—8%, что выше нормы но НД—не менее 5% [4]. Для получения сухого экстракта необходимо использовать плоды шиповника с содержанием аскорбиновой кислоты (витамина С) не менее 2%, однако чаще всего на рынок поступает сырье, в котором содержание витамина С ниже нормы. Применение ферментных препаратов при переработке такого сырья позволяет получить продукт, соответствующий НД по содержанию витамина С. Экстракт, полученный с примепепием ферментных препаратов, и упаренный до содержания сухих веществ 30%, используется па заводе для приготовления таблеточной массы на установке Глатт, что в значительной мере сокращает процесс изготовления ядер драже, в то время как использование такого же концентрата, полученного без применения фермента на установке Глатт невозможно из-за значительной вязкости. [c.159]

В 1879 г. был открыт первый протеопитический фермент растительного происхождения. Уже давно было известно, что плоды и сок дынного дерева при добавлении к мясу в про-дессе варки делают последнее более мягким, А,Вюрд обнаружил, что не только сок плодов, но сок, находящийся в листьях и стволе дынного дерева, обладает способностью расщеплять белки (23). Осаждение спиртом сока дынного дерева приводило к получению не очень чистого препарата нового фермента, названного папаином. [c.121]

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих сейчас способов иммобилизации ферментов. Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Э. Гриффин провели успешную иммобилизацию инвертазы путем адсорбции на активированном угле и геле гидроксида алюминия. Этот же метод был использован для получения первого технологического иммобилизованного ферментного препарата в 1969 г., когда И. Шибата с сотрудниками осуществили гидролиз Ы-ацетил-Л, -аминокислот под действием адсорбци-онно иммобилизованной -аминоацилазы. В настоящее время адсорбционная иммобилизация благодаря целому ряду преимуществ является наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментных препаратов промышленного значения. [c.46]

Остановимся на подходе, который заключается в выведении продуктов из сферы реакции. При обеспечении условий, когда целевой (или какой-либо другой) продукт ферментативного превращения выводится из сферы реакции, равновесие реакции сдвигается в сторону его образования. Существует ряд методов, реализующих этот принцип. Хронологически первым, пожалуй, является метод, основанный на подборе условий, при которых синтезируемый продукт обладает низкой растворимостью. Достоинства метода были показаны при получении анилидов и фенил-гидразидов ряда аминокислот, сиитезе некоторых олигопептидов (М. Bergmann, Н. Fraenkel- onrat, 1937). К недостаткам метода относится его применимость лишь к ограниченному числу соединений л невозможность использования в качестве катализатора иммобилизованных препаратов ферментов. [c.51]

Особо следует отметить работы тех же авторов по полимерным производным стрептокиназы с полисахаридными носителями [64, 65]. Полученные конъюгаты эффективно разрушают искусственные тромбы, а конъюгат на основе диальдегиддск-страна ( Стрептодеказа ) — первый в мире полимерный препарат фермента, который разрешен для клинического применения и показал хорошие результаты [66]. Среди других полимерных конъюгатов протеолитических ферментов, обладающих тромбо-литическими свойствами, конъюгаты урокиназы [65, 67]. [c.180]

При анализе белковых фракций, смываемых с колонки при ионообменной хроматографии НАД-киназы из печени кролика, был обнаружен фактор, способный изменять активность фермента. Этот фактор не связывается с ионообменником и выходит при нанесении образца фермента на колонку в первой белковой фракции. Вопрос о том, какова его природа и не является ли он кальмодулином, будет рассмотрен ниже. Фактор не обладает ферментативной активностью, термостабилен (его эффект сохраняется после прогревания в течение 5—7 мин при 10(Г ), не проходиг через мембрану при диализе или ультрафильтрации. При исследовании действия фактора на НАД-киназу из печени кролика мы не всегда наблюдали однозначный эффект, что выражалось в следующем. Во-первых, степень активации варьировала в широких пределах (от 30 до 150%). а при большом избытке фактора наблюдали даже десятикратную активацию. Причина неодинаковой активации, по-видимому, кроется в различном содержании самого активатора в разных частично очищенных препаратах, используемых в опыте. Во-вторых, фактор оказывал влияние не на все препараты фермента. Степень активации зависела также от типа НАД-киназы (а или р). Было выяснено, что более выражено активирующее действие фактора на а-форму НАД-киназы [17]. При этом из двух форм фермента а-типа с молекулярным весом 150 000 и 180000 в большей степени активируется первая, наименее активная форма. На первый взгляд эти данные трудно объяснить действием одного активатора. Для интерпретации получен ных результатов проще всего было бы допустить присутствие в использованных частично очищенных препаратах, помимо активатора, еще и ингибитора фермента. Для многих ферментов показана возможность регуляции каталитической активности пра участии как активатора, так и ингибитора. Очевидно, что конечный эффект будет зависеть только от соотношения активатор/ин-. гибитор в используемых препаратах. Активация может наблюдаться, когда действие активатора преобладает над действием ингибитора. В противном случае выявляется ингибирование фер-мента. Эффект отсутствует, когда действие активатора уравнобе-шивается действием ингибитора. [c.150]

В опытах по получению гомогенных препаратов рестриктаз, как уже отмечалось, широко используется ФРП и ДЭАЭц — сорбенты, нашедшие применение в большинстве схем выделения функционально очищенных препаратов этих ферментов. Наличие количественных данных о выходах и степени очистки, достигаемой с использованием этих ионитов в препаративных опытах, убеждает в высокой эффективности хроматографии на ФР П, в основном использованной на первых стадиях очистки. Сказанное подтверждают данные о достижении при хроматографии на ФРП 10-ти кратной [74, 152], 40-кратной [107, 184, 228], 50-ти кратной [154], 100-кратной [29] и даже 226-ти кратной [58] очистки. Потери целевых ферментов во всех случаях не превышали половины, а в некоторых составили менее 20% [184, 283]. Для применения ДЭАЭц, включаемой в схемы очистки гомогенных рестриктаз в основном на предпоследних стадиях, характерна степень очистки, равная 1,3—6-кратной [13, 58, 118, 138, 302]. Только в нескольких случаях достигаемая степень очистки была близкой к 10-ти кратной [72, 177], а в случае рестриктазы АИ I равнялась 23-кратной [299]. За исключением последнего случая, высокоэффективная очистка (более чем десятикратная) сопровождалась большими (60—90%) потерями целевых ферментов [72, 177]. Аналогичные, как и в случае ДЭАЭц, показатели в отношении достигаемой степени очистки характерны и для применения (в основном на предпоследних стадиях очистки) хроматографии на ГАП [72, 107, 118, [c.168]

Подобные реакторы нашли применение в фармацевтической промышленности, например при синтезе из гидрокортизона антиревматоидного препарата преднизолона. Кроме того, они могут служить моделью для применения с целью синтеза и получения незаменимых факторов, поскольку при помощи иммобилизованных ферментов и коферментов можно направленно осуществлять сопряженные химические реакции (включая биосинтез незаменимых метаболитов), устраняя тем самым недостаток в веществах при наследственных пороках обмена. Таким образом, при помощи нового методологического подхода наука делает свои первые шаги в области синтетической биохимии . [c.164]

Химическое или биологическое получение и подготовка предшественника в этом способе является первой ступенью производства. Сюда же входит подготовка ферментного препарата, с помощью которого будет производиться трансформация предшественника в L-лизин. Для этого выращивается соответствующий продуцент ферментов, вернее получается биомасса микроорганизма, обладающая требуемым комплексом ферментов. Биомасса отделяется от ку льтуральной жидкости и используется либо непосредственно для трансформации, либо клетки предварительно разрушаются (ультразвуком, толуолом, ацетоном, СВЧ,. механически и т.д.). [c.28]

Микробиологический метаболизм основного алкалоида табака— никотина — исследовался несколькими группами ученых [39, 45—52]. Было найдено, что, как и при окислении никотиновой кислоты, введение оксигруппы в положение 6 пиридинового кольца никотина является первой стадией длинной цепи реакций деградации. Микроорганизм Arthroba ter oxydans применялся либо чаще всего интактно, либо в качестве источника бесклеточного ферментного препарата [45], либо (в одном примере) для получения очищенного фермента [47]. Информация [c.125]

Кристаллизация. Объединенные фракции насыщали сульфатом аммония (до 50% предельной концентрации) и центрифугировали (50ООО f, 30 мин). К надосадочной жидкости добавляли твердый сульфат аммония до легкого помутнения. Образование первых кристаллов наблюдали через 12 сут хранения раствора при 4°С. Кристаллизация завершалась после добавления 4%-ного раствора сульфата аммония. Спустя сутки кристаллы отделяли центрифугированием. Препарат растворяли в буферном растворе (0,1 М раствор фосфата натрия-f 1 мМ ЭДТА с pH 7,6) и повторяли кристаллизацию по указанной методике. Выход 4,4-кратно очищенного фермента составлял 50%. Гомогенность полученного фермента была подтверждена разными методами. [c.27]

В настоящее время общепринято, что ферменты являются белками. Финский биохимик А. И. Виртанен выдвинул обратное положение, что белки представляют собой ферменты. Если это второе положение нужно рассматривать как преувеличение, то первое справедливо без исключений, хотя, правда, каталитической активностью могут обладать и фрагменты белковой молекулы. Первое доказательство белковой природы ферментов было получено в 1926 г., когда фермент уреазу выделили в виде чистого кристаллического препарата и установили, что этот фермент является белком глобулином. Эти результаты американского ученого Самнера противоречили взглядам выдающегося немецкого химика Рихарда Вилльштеттера. Вилльштеттеру в некотором отношении не повезло, так как он работал с ферментом пероксидазой, обладающей чрезвычайно высокой каталитической активностью. В процессе очистки были получены активные препараты пероксидазы, не содержащие заметных количеств азота, а в ряде случаев в них не удавалось обнаружить ни углерода, ни азота. После выделения кристаллической уреазы Вилльштеттер считал, что полученный белок был лишь неспецифическим носителем лабильной и каталитически [c.9]

В процессе распада гистидина с промежуточным образованием уроканиновой (р-имидазолакриловой) кислоты (стр. 393) первое звено состоит в дезаминировании гистидина. Фермент, осуществляющий эту реакцию, различные авторы называли по-разному гистидиндезаминаза, дезаминогистидаза, гистидин-а-дезаминаза и гистидаза. Последним термином прежде обозначали ферментную систему, вызывающую более глубокое разложение гистидина с расщеплением имидазольного кольца. В дальнейшем было обнаружено, что в препаратах гистидазы , получение которых описано в старых работах, содержатся уроканаза и, возможно, еще и другие ферменты. Реакция. [c.195]

Некоторые L-аминокислоты, в том числе гистидин, цистеиновая кислота, цистеинсульфиновая кислота, 3,4-диоксифенилала-нин, глутаминовая кислота и 5-окситриптофан, декарбоксилируются ферментами, обнаруженными в тканях млекопитающих. Реакции декарбоксилирования в общем не играют в количественном отнощении существенной роли в превращении аминокислот в организме животных вместе с тем некоторые реакции декарбоксилирования, например те, которые ведут к образованию серотонина и гистамина, имеют большое биологическое значение. У млекопитающих первая аминокислотная декарбоксилаза была открыта в 1936 г. Верле, который обнаружил, что при инкубировании гистидина с ферментными препаратами из почек кролика образуется вещество, обладающее физиологическими свойствами гистамина [200]. Фермент, в дальнейшем полученный в очищенном виде, катализирует следующую реакцию [201, 202] [c.200]

Первую ступень синтеза глутатиона, а именно образование у-глутамилцистеина из цистеина и глутаминовой кислоты [реакция (1), см. выше], наблюдали в опытах с ферментными препаратами из зародышей пшеницы [539] и из печени свиньи [536]. Фермент из зародышей пшеницы был подвергнут 50-кратной очистке показано, что для его действия обязательно присутствие аденозинтрифосфата и ионов магния и калия. Фермент катали-зирует также включение 5 -цистеина в -глутамилцистеин путем обмена в присутствии аденозинтрифосфата и ионов магния и калия. Сходный фермент получен из печени свиньи для этой системы не требуется наличия ионов калия, однако ионы магния оказались необходимыми. Ферменты из зародышей пшеницы и из печени свиньи не идентичны ферменту, синтезирующему глутамин. В опытах с ферментом из зародышей пшеницы наблюдали обмен между неорганическим фосфатом и аденозинтрифосфатом в присутствии глутамата, а также обмен фосфатной группой между АДФ и АТФ в отсутствие добавленных аминокислот. Интерпретация этих данных пока затруднительна. [c.269]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология