Векторы для трансформации растений с помощью

Векторы для трансформации растений с помощью [c.26]

В данной главе предполагается, что цель эксперимента заключается просто во встраивании гена, клонированного ранее в Е. соЫ, в обычный вектор для трансформации растений затем он должен быть перенесен с помощью конъюгации в агробакте-рии. В результате получают штамм, готовый для трансформации. Обычные методы рекомбинантных ДНК, бактериальной трансформации и конъюгации, выделения и анализа плазмид, как [c.34]

Поскольку физиологически и морфологически нормальные растения невозможно регенерировать из онкогенных клеток корончатых галлов, большинство современных векторов на основе Ti-плазмид неонкогенны. Как упоминалось выше, главная особенность онкогенных систем трансформации с помощью агробактерий состоит в том, что галлы и косматые корни вырастают из эксплантатов, и, следовательно, трансформированные клетки легко отличить. Это очень важное свойство, поскольку трансформация эксплантатов с помощью неонкогенных векторов часто не позволяет отобрать резистентные к антибиотику ткани на фоне нетрансформированных клеток. Таким образом, онкогенные векторы, которые к тому же несут гены устойчивости к антибиотикам [38, 39], очень полезны для быстрого подбора наилучших эксплантатов и методик инокуляции, чтобы получить оптимальную трансформацию. Индукция микроопухолей в местах поранения с большой площадью поверхности, таких, как срезы клубня или главного корня (рис. 2.7), тоже представляет собой удобный способ получения. нескольких тысяч легко отличимых, независимых трансформантов. [c.109]

В данном разделе мы останавливаемся на том, как определить оптимальную концентрацию ПЭГ 6000 для эффективного поглощения плазмиды протопластами растений. Однако ту же самую схему можно использовать и для оптимизации других параметров (например, подбора ДНК-носителя, среды для поглощения, pH, времени и температуры инкубации, концентрации ДНК, условий перемешивания и предварительной обработки протопластов), которые предположительно влияют на процесс поглощения. После стимуляции эндоцитоза любая плазмида, адсорбированная на внешней стороне протопластов, удаляется с помощью ДНКазы. Затем из заданного количества протопластов выделяют суммарную ДНК и оценивают количество встроенного в нее вектора с помощью ДНК-ДНК-гибридизации, используя радиоактивно меченную ДНК вектора в качестве пробы. Кроме того, для установления целостности поглощенной векторной ДНК можно использовать блоттинг-гибридизацию по Саузерну [11]. Такие методы в сочетании с анализом временной экспрессии вектора в обработанных плазмидой клетках позволяют быстро оптимизировать процедуры трансформации с помощью ПЭГ. [c.204]

Растительные клетки не содержат собственных плазмид. В этом случае в качестве основы для конструирования трансформирующих векторных систем в принципе могут использоваться независимо реплицирующиеся геномы различных растительных вирусов. Такие системы были созданы на основе генома вируса мозаики цветной капусты. Однако все наиболее соверщенные системы векторов растений получены на основе плазмид из семейства необычных бактериальных плазмид, носящих название pTi. Эти плазмиды образуют природную систему трансформации, с помощью которой осуществляется перенос сегаентов плазмидной ДНК в геномы разнообразных двудольных растений. [c.273]

Рис. 18.11. Плазмидный вектор, содержащий кластер генов хитиназы риса и кластер генов устойчивости к гигромицину, использовавщийся для трансформации протопластов риса. Трансформацию осуществляли обработкой протопластов полиэтиленгликолем в присутствии плазмидного вектора. Затем отбирали клетки, устойчивые к гигромицину, и проводили тестирование клеток на наличие генов хитиназы с помощью гибридизации по Саузер-ну и на наличие самой хитиназы методом Вестерн-блоттинга. Далее из клеток регенерировали целые растения.

Коинтегративный вектор. Один из способов, облегчающий введение чужеродной ДНК в геном растения, заключается в использовании коинтегративных векторов. Смысл подхода состоит в следующем (рис. 2.3). Весь процесс введения чужеродного гена в геном растений делится на два этапа клонирование гена, который следует встроить в растительный геном, и собственно трансформация растительной клетки. Эти два этапа осуществляются с помощью различных векторов. [c.54]

Первоначально такие векторы использовались для трансформации в тех случаях, когда трудно регенерировать целые растения из отдельных клеток. Растения многих видов могут регенерировать из культуры корней, индуцированных А. rhizogenes, путем соматического эмбр1И0генеза или органогенеза. Механизм, с помощью которого подавляется фенотип косматых корней (что обусловливает возможность морфогенеза побегов), до конца не выяснен. Регенерированные из косматых корней растения часто морфологически изменены, характеризуются складчатостью листьев, плагиотропной корневой системой, низкорослостью и низкой фертильностью [52]. [c.26]

Трансформация протопластов ОМОТ-векторами с помощью какого-либо из методов, перечисленных в разд. 3.1.2, может быть предпринята по отношению к любому виду растений, для которого разработана система протопластов. Однако даже в этом случае, если жизнеспособные протопласты, способные к формированию клеточной стенки и делению, можно получить в достаточных количествах, у многих культурных видов такие клетки не являются тотипотентными. Таким образом, кроме работ по временной экспрессии, трансформация протопластов с помощью ВМОТ-векторов в действительности не вышла за пределы круга видов, чувствительных к агробактериям. Кроме того, существуют и значительные основания предполагать, что прохождение клеток через стадию недифференцированной культуры тканей тоже способно привести к изменениям генотипа растения. По этим двум причинам многие лаборатории в настоящее время разрабатывают методы трансформации, которые не нарушают нормальное развитие и клеточный цикл растения. [c.201]

В некоторых успешных методиках поглощения ДНК с помощью ПЭГ используют ДНК-носитель преимущественно для того, чтобы нейтрализовать влияние любого иеспецифического связывания или деградации векторной ДНК во время поглощения [31, 38, 42, 43]. Однако ясно, что неспецифическая ДНК-носитель тоже включается в ядерный геном трансформированных тканей растения последствия этого процесса в настоящее время ие известны. Добавление векторной ДНК в виде копре-ципитата с фосфатом кальция может быть предпочтительнее [21]. В этом случае состав поддерживающих сред для протопластов может быть изменен. Есть некоторые данные, что более высокие частоты трансформации могут быть получены при использовании ДНК вектора, переведенной в линейную форму. [c.210]

С помощью электропорации были получены стабильно трансформированные растения или клеточные линии некоторых видов растений. К йх числу относятся табак [38], морковь [22] и кукуруза [13]. Шиллито с соавторами [38] использовал вектор, содержащий доминантный селективный маркерный ген (npt-ll), который ранее успешно применяли в экспериментах по пере носу генов с помощью ПЭГ [31]. Эту плазмиду вводили с помощью электропорации в протопласты табака и отбирали трансформанты на основе резистентности к канамицину. Дан<-ные исследования, очевидно, отнимают больше времени, чем эксперименты по временной экспрессии, но в конечном итоге позволяют разработать методику стабильной трансформации. В настоящее время при использовании методов электропорации частота трансформированных колоний может достигать 2%. что более эффективно, чем трансфекция ДНК с помощью ПЭГ. Пути интеграции перенесенной ДНК такие же, как и при иС пользовании ПЭГ, и в обоих случаях перенесенные гены наследуются в соответствии с нормальными менделевскими соотношениями. [c.216]

Влияние микроорганизмов не всегда позитивно некоторые из них вызывают тяжелые заболевания у человека, животных и растений. Нередки случаи, когда микроорганизмы приводят к порче сельскохозяйственной продукции, разрушению подземных частей зданий, трубопроводов и металлических конструкций шахт. Изучение свойств таких микроорганизмов позволяет разработать эффективные способы защиты от вызываемых ими повреждений. С другой стороны, положительное значение микроорганизмов для практики невозможно переоценить. С помощью грибов и бактерий готовят хлеб, вино, пиво, квас, молочнокислые продукты, закваски. При участии микробов получают ацетон и бутанол, уксус, лимонную кислоту, некоторые витамины, ряд ферментов, антибиотики и каротиноиды. Микробы участв(уют в трансформации стероидных гормонов и других соединений. Их используют для получения белка и ряда аминокислот. Реализуется идея использования микробных ферментов в диагностических целях. Применение микробных комплексов для превращения сельскохозяйственных отходов в биогаз (смесь метана и углекислоты) или этанол открывает возможность создания принципиально новых систем восполнения энергетических ресурсов. В последние годы микроорганизмы, особенно прокариоты, широко применяют в качестве объектов генной инженерии для клонирования генов и создания векторов. [c.21]

Структура таких векторов стандартна. Они содержат все необходимые элементы для манипулирования ими в клетках Е. oli, маркер для селекции растительных трансформантов и полилинкер (рис. 12.5,а). Особенно важно отметить, что эти векторы можно использовать для трансформации протопластов как однодольных, так и двудольных растений. Их небольшой размер (несколько т.п.н ) позволяет достигать достаточно высокого уровня трансформации (10 —10 ) при введении рекДНК в протопласты с помощью полиэтиленгликоля, липосом и методом электропорации. Апробирован также метод прямой микроинъекции рекДНК в ядра протопластов. Частоты трансформации при этом [c.382]

В отсутствие специфического вектора прямая трансформация по крайней мере некоторых растительных клеток осуществляется с помощью трансфекции фрагментами чужеродной ДНК, добавленными в культуральную среду. Как и клетки животных, клетки растений поглощают ДНК и она ин-тефирует с клеточным геномом, в результате чего образуются стабильно трансформированные клетки. Однако эффективность прямой трансформации весьма низка. Отобрать трансформанты, появляющиеся с частотой примерно 1 на 10 обработанных клеток, можно лищь с помощью высокочувствительных методов. Для повыщения эффективности прямого введения ДНК в клетки растений можно использовать метод электропорации. В этом случае трансформированными становятся до 1% клеток, а кроме того, такой способ можно применять в случае как однодольных, так и двудольных растений. С помощью рекомбинантных ДНК были трансформированы различные растительные клетки, в том числе клетки табака, петуньи, томатов и подсолнечника. Для трансформации часто используют протопласты, полученные путем разрущения жестких клеточных стенок с помощью целлюлазы, в результате чего клетки становятся проницаемыми для ДНК. При переносе трансфицированных протопластов в соответствующую среду клеточная стенка восстанавливается. [c.273]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология