Колонка с ферментом

Ранее нами было обнаружено, что при пропускании раствора гиалуронидазы через колонку с хитином происходит сорбция балластных веществ и, возможно, ингибиторов фермента, что приводит к увеличению удельной активности фермента. Использование обнаруженного нами факта при разработке технологии очистки гиалуронидазы требует дальнейшего изучения этого процесса и, в частности, определения емкости сорбента. Для этого на колонки с одинаковым объемом сорбента наносили различные количества фермента. Результаты экспериментов сведены в таблице. [c.95]

Химический реактор состоит из колонки, заполненной гранулами иммобилизованного фермента. Исследование показало что осуществляемый ферментативный процесс лимитируется диф фузией. Что в общем случае более предпочтительно для увеличе ния эффективности ферментативного процесса — измельчение гра нул иммобилизованного фермента или уменьшение начальной кон центрации фермента Ответ пояснить. [c.274]

Рабочей частью химического реактора является колонка заполненная гранулами фермента, иммобилизованного в геле полиакриламида [Е]о=1 10 М). Через колонку пропускают раствор субстрата в концентрации 1-10- М. Ферментативная реакция, в растворе характеризуется параметрами кат=Ю сек-, /Ст(каж)= = 0,1 М. Каков должен быть размер гранул иммобилизованного фермента, чтобы диффузия не играла существенной роли в ферментативной реакции, если коэффициент диффузии субстрата в геле равен 10- см сек. [c.275]

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Палиндромы в ДНК обнаруживаются путем кратковременной ренатурации денатурированной ДНК, гидролиза всей не успевшей ренатурировать ДНК нуклеазой S1 (специфической для однонитевой ДНК) и задержания на колонке оксиапатита двунитевых фрагментов, которые в этих условиях образуют только палиндромы. Лин и Ли [Lin, Lee, 1979] вели денатурацию фрагментированной ультразвуком ДНК в щелочной среде, а ренатурацию — путем быстрой нейтрализации раствора и выдерживания его при повышенной температуре в течение 2 с. Затем раствор энергично охлаждали до 4° и диализовали на холоду против 0,1 М Na-ацетатного б фера (pH 5), содержавшего 0,1 мМ ацетата цинка, что необходимо для действия нуклеазы S1. Кроме того, к раствору добавляли половинный объем диоксана, который, как оказалось, почти втрое ускоряет и повышает эффективность действия фермента. Наконец, вносили саму нуклеазу 81 (80 ед/мл), выдерживали 45 мин при 37°, а затем, как обычно, гидролизат переводили диализом в 0,12 М Na-фосфат- [c.242]

Для сорбции лучше всего образец выделяемого вещества растворять непосредственно в буфере, из которого будет производиться сорбция, и, если необходимо, проводить замену состава солей, присутствующих в образце, с помощью диализа или гель-фильтрации. Если вещество, образующее в данных условиях прочный комплекс с иммобилизованным аффинным лигандом, выделяют колоночной хроматографией, то объем образца, вводимого в колонку, может быть любым. Однако, если выделяют аффинной хроматографией вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, объем наносимого образца не должен превышать 5% удерживаемого объема, для того чтобы предотвратить элюирование выделяемого вещества неадсорбированным материалом. Если выделяют вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, его элюирование с колонки происходит часто даже без замены буфера. В этом случае выделяемое вещество получают в разбавленном растворе. Для иллюстрации сказанного можно сопоставить хроматографию химотрипсина на сефарозе с присоединенным метиловым эфиром е-аминокапронил-О-триптофана с хроматографией этого же вещества на сефарозе с непосредственно связанным метиловым эфиром О-триитофаиа (рис. 5.4) [8]. Для элюирования химотриисина с нерастворимого носителя, на котором ингибитор укреплен через е-аминокапроновую кислоту в качестве прострапственной группы, необходимо изменение pH, при этом фракция химотрипсина элюируется в виде острого пика. Если ингибитор присоединен непосредственно к нерастворимому носителю, его пространственная доступность понижена, и химотрипсин только замедляет свое движение через колонку. Фермент элюируется в значительно большем объеме, при том же pH, в непосредственной близости к неактивному материалу. [c.264]

Пример градиентного элюирования специфическим элюентом приведен на рис. 10.6 нативный лизоцим, специфически сорбированный на три-(М-ацетилглюкозамин) —сефарозе, элюируется концентрационным градиентом три-(Ы-ацетилглюкозамина), различной крутизны [7]. Концентрационный градиент специфически элюирующего реагента всегда задавался после промывки исходным буфером. Количество наносимого на колонку фермента, параметры колонки, состав буфера и другие условия были одинаковыми для трех разбираемых случаев. Отличались только скорости изменения концентрации три-(Ы-ацетилглюкозамнна), как это видно из рисунка. Выходы белка составляли приблизительно 90%. Лизопим [c.267]

Другой важной областью применения иммобилизованных ферментов является производство аминокислот с помощью аминоацилазы. Колонки с амино-ацилазой используются в Японии для производства сотен килограммов Г-метионина, Г-фенилаланина, Г-триптофана и Г-валина. Ферментно-полимерные коньюгаты широко используются в аналитической и ьслинической химии. Иммобилизованные на колонках ферменты могут использоваться повторно в качестве специфических катализаторов при определении различных субстратов. Папример, разработаны ферментные электроды для потенциометрических и амперометрических определений таких веществ, как мочевина, аминокислоты, глюкоза, спирт и молочная кислота. [c.92]

В настоящее время в фармацевтической промышленности нашли практическое применение два процесса. Первый из них—это синтез аналога кортизона, преднизолона, который используется в качестве лекарственного препарата для лечения ревматоидных артритов. Предшественник стероида, соединение Рейх-штейна, пропускают последовательно через две колонки, каждая из которых содержит специфический фермент, присоединенный к полиакриламидному полимерному носителю [128]. При этом происходит реакция гидроксилнровання прохн-рального С-11, причем конфигурация сохраняется. [c.261]

Благодаря высокой активности и специфичности Ф. к. находит применение в пром-сти. Широко примен. протеолитические ферменты, липазы, глюкозооксидаза, каталаза и др. Новые успехи в пром. применении Ф. к. связаны с получ. т. н. иммобилизов. ферментов, искусственно связанных с нерастворимыми в воде носителями и длительно сохраняющих (полностью или частично) каталитич. св-ва. Иммобилизов. ферменты фактически являются гетерог. биокатализаторами, к-рые м. б. использованы в колонках или проточных аппаратах, что позволяет перевести мн. хим. процессы на непрерывный режим. Получение иммобилизов. ферментов и их примен. для технол. целей входит в круг проблем, решаемых инженерной энзимологией. [c.617]

Так, при очистке так называемого маннитол-специфичного фермента II Е. oli (входящего в состав системы фосфорилирования сахаров, переносимых через мембрану) для извлечения фермента из мембраны использовали 0,5%-ный раствор ДОХ. В его присутствии фермент сажали на колонку гексилагарозы. При элюции в раствор ДОХ добавляли еще и Луброл РХ до 0,5%. Этот детергент не только способствует элюции, но и необходим для проявления активности фермента, поэтому дальнейшую очистку — путем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе — вели тоже в присутствии [c.185]

Авторы дайной работы обратили внимание на то, что n продажной октилсефарозе L-4B фирмы Pharma ia имеются какие-то особо гидрофобные примеси. Часть исследуемого ими фермента сорбировалась на колонке так прочно, что ЭГ ее не снимал. Для элюции этой доли фермента нужно было использовать 1 %-ный раствор холата натрия. Столь прочное задержание части фермента было связано именно с особенностями матрицы, поскольку при внесении на новую порцию сефарозы препарата, ранее снятого с колонки эти-ленгликолем, часть его снова так же прочно сорбировалась на матрице. Можно предположить, что при модификации сефарозы в октиловом спирте присутствовали более высокомолекулярные примеси. [c.188]

Для очистки мембранной D-лактатдегидрогеназы Е. соИ хроматографией на оксиапатите [Pratt et al., 1979] был использован пологий линейный градиент концентрации (0—0,2 М) К-фосфатного буфера, pH 7,2 (500 мл для колонки размером 2,6 X 20 см). Растворимость белка обеспечивали включением в состав буфера детергентов (1% Тритона Х-100 и 0,1% ДДС-Na). Очистке на оксиапатите предшествовали освобождение фермента из ме.мбрин с помощью дезоксихолата натрия, хроматография на DE-52 и гель-фильтрация на сефадексе G-200. На всех хроматографических этапах очистки в составе элюентов тоже присутствовали детергенты. [c.234]

П р и м е р 5. Очистка ДНК-полимеразы I из Е. oli [Rhodes et al., 1979]. На первых этапах здесь использовали грубую очистку осаждением полиэтиленимином и сульфатом аммония. Затем следовал этап хроматографической очистки на колонке фосфоцеллюлозы, уравновешенной 0,04 М К-фосфатным буфером (pH 6,9) с обычными добавками, включая 5% глицерина. Введение глицерина продиктовано лабильностью фермента — его активность снижается вдвое за сутки. Препарат вносили в том же буфере, им же промывали колонку, а затем вели элюцию линейным градиентом концентрации этого буфера (0,04—0,3 М). Таким образом, вытесняющий белок контрион (К+) поставлялся самим буфером. [c.304]

Между тем краситель III вовсе не сорбирует данный фермент, в то время как с колонки сефарозы, модифицированной красителем IV, фермент удается элюировать лишь 0,84 М КС1 [Lowe et al., 1980]. [c.367]

Перед использованием колонки с аффинным сорбентом ее имеет смысл промыть раствором бычьего сывороточного альбумина (2 мг/мл). Было замечено, что в результате этого улучшается качество очистки и фракционирования методом конкурентной элюции целого ряда ферментов. По-видимому, БСА блокирует на сорбенте места неспецифической сорбции ферментов [Ramadoss et al., 19831. [c.368]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология