Гель-электрофорез в полиакриламиде

Рис. 4-49. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле. Индивидуальные белки образуют комплекс с молекулами додецилсульфата натрия, несущими отрицательный заряд, и мигрируют через пористый гель полиакриламида в виде отрицательно заряженного комплекса ДСН-белок. Поскольку скорость передвижения в этих условиях тем выще. чем меньще размеры полипептида, этот метод может быть использован для определения приблизительной молекулярной массы полипептидной цепи, а также для изучения субъединичного

Нуклеиновые кислоты характеризуются отчетливым отрицательным зарядом и очень высокой молекулярной массой. Поэтому нейтральные гомогенные гели с достаточно большими порами обеспечивают хорошее разделение этих соединений. Размер пор, требуемый для исследования нуклеиновых кислот и их субъединиц, можно определить методом гель-электрофореза при градиенте концентрации, как для белков (см. табл. 12.6). Если механические свойства неплотного полиакриламидного геля непригодны, можно использовать смешанный гель, содержащий 2,5% полиакриламида и 0,5% агарозы. При анализе субъединиц более низкой молекулярной массы концентрацию полиакриламида увеличивают до 3% при 0,5%-ной концентрации агарозы в [c.350]

Большое значение при доказательстве и определении молекулярной массы субъединиц имеют ультрацентрифугирование, ДСН-электрофорез в полиакриламиде, гель-фильтрация и другие уже рассмотренные ранее методы (разд. 3.5.4). В этой связи надо упомянуть, что в условиях диссоциации не только регуляторные, но и каталитические функции ферментов сильно повреждаются или совершенно теряются. [c.388]

Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

Недостатками метода электрофореза в крахмальном геле являются нестандартность его состава и свойств, а также непрозрачность и некоторые другие нежелательные свойства. Более удачной средой для электрофореза в геле является полиакриламид. [c.186]

Гель-электрофорез проводится в агарозном или полиакриламидном геле. Это исключительно гибкий метод разделения варьируя структуру геля и состав буферного раствора, можно проводить разделение на основе различия в молекулярных массах, изоэлектрических точках и биоспецифическом сродстве. Особенно высокого разрешения достигают при гель-электрофорезе в полиакриламиде [39], так как здесь дополняют друг друга электрофорез и молекулярноч итовой эффект. Сыворотка, например, расщепляется на 20 полос, в то время как при электрофорезе в агарозе появляется лишь 5 полос. [c.351]

Электрофорез в гелях- применяют гл.обр. для разделения высокомол. соед., напр, белков. Для этого обычно в виде блоков и колонок используют гели крахмала и полиакриламида. Адсорбция разделяемых в-в и электроосмос в этих материалах незначительны. [c.437]

Другой, наиболее употребимый тип электрофореза осуществляется на носителе это классические носители для хроматографического разделения (бумага, ацетат целлюлозы, гели из крахмала и полиакриламида), выбираемые в соответствии с характеристиками (размер, форма) молекул, подлежащих разделению, и их собственными параметрами структуры (пористость, вязкость). [c.87]

Электрофорез использовали в основном для подтверждения однородности фракций выделенных полисахаридов, а также в экспериментах по фракционированию в щелочном растворе полиоз из еловой холоцеллюлозы [67]. Этот метод, а также гель-проникающая хроматография на полиакриламиде не обеспечили успеха при фракционировании. Гель-проникающая хроматография на декстрановых гелях дала хорошие результаты при разделении смесей полиоз, [c.35]

Электрофорез в полиакриламид- Слой геля [c.23]

Одним из недостатков промышленных солюбилизаторов является их высокая стоимость. В связи с этим можно упомянуть работу [40] , в которой описан недорогой способ анализа меченных тритием РНК после разделения электрофорезом в геле. Гели, содержащие 2%) полиакриламида и 0,5% агарозы, вымачивают в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте, после чего их разрезают и отрезанные фрагменты помещают в изме- [c.143]

Возможность для дальнейшего улучшения разделения белков открывает сочетание изоэлектрического фокусирования с электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН, а также использование различных видов равномерных или скачкообразных градиентов концентрации полиакриламида. [c.228]

Электрофорез во втором направлении можно также проводить в геле с градиентом концентрации полиакриламида в присутствии ДСН. Такая система была использована для разделения рибосомных белков [89]. Применение градиента геля во втором направлении целесообразно, по-видимому, в тех случаях, когда разделяемые белки имеют молекулярные массы, различающиеся в широких пределах. [c.231]

Применяемый для электрофореза гель полиакриламида получают полимеризацией двух мономеров акриламида и метилен-бис-акриламида (МБА).в присутствии катализаторов, представляющих собой смесь раствора персульфата аммония с N,N,N N -тeтpaмeтилэтилeндиaмидoм (ТЕМЕД). При этом линейные цепи полиакриламида сшиваются метиленовыми мостиками. Гель обладает ярко выраженной гидрофильностью благодаря наличию в структуре правильно чередующихся амидных групп. [c.154]

Молекулярную массу белков можно также определять посредством гель-электрофореза в полиакриламиде [41]. Мономеры, предназначенные для образования геля, растворяют в буфере и полимеризуют в стеклянных трубках или между пластинками при использовании в качестве сшивающего агента бисакриламида. Большая разделяющая способность метода объясняется молекулярно-ситовым эффектом. [c.361]

Скуде и Джеппсон [1191] в первом направлении проводили ИЭФ в полиакриламидном геле, а антитела включали в комбинированный полиакриламидно-агарозный гель (2% полиакриламида и 0,5% агарозы), вполне пригодный для иммунопреципитации. Во время электрофореза во втором направлении необходимо было накрывать гель тонкой полимерной пленкой, чтобы предотвратить сокращение объема полиакриламидного геля. Джонсон и др. [643] проводили электрофорез в первом направлении в комбинированном геле (5% полиакриламида и 0,8% агарозы), а во втором — в агарозном геле, содержащем антитела. [c.261]

Принцип метода. Миграция и разделение белков происходят в небольших цилиндрических колонках полиакриламида. [Термин диск-электрофорез происходит от дископодобной формы фрагментов колонки геля, в которых содержатся фракции, а также от английского слова dis ontinuous , которым названа неоднородная ( прерывистая ) буферная система, обычно используемая в этом методе.] [c.88]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

В этом методе электрофореза используется электрофоретическое перемещение макромолекул в среде с градиентом плотности пор геля. Конечный результат — разделение смеси на отдельные компоненты в соответствии с размерами молекул, при этом электрофоретическая подвижность не играет существенной роли. Необходимым условием такого разделения является наличие у исследуемых соединений зарядов одного типа и отличной от нуля электрофоретической подвижности в применяемой среде. Движение веществ от старта постепенно тормозится вследствие уменьшения пор геля, и с увеличением расстояния от старта подвижность макромолекул постепенно уменьшается. При больших молекулярных массах нодвил ность уменьшается почти до нуля. Ограничение подвижности, вызываемое гелем, приводит к фокусированию зон. Для того чтобы подвижность снижалась до нуля, наряду с градиентом концентрации акриламида необходимо наличие градиента степени сшивки геля. Поэтому в новых типах гелей имеется градиент концентраций и полиакриламида, и бисакриламида. На этих гелях можно разде- [c.299]

Несмотря на то что полиакриламид стал применяться в качестве носителя для электрофореза лишь после 1960 г., этот материал в настоящее время наиболее широко используется при разделении смесей макромолекул кислого или основного характера. Сейчас полиакриламидный гель как носитель практически вытеснил бумагу и крахмальный гель, поскольку в случае белков и нуклеиновых кислот он дает очень хорошее разрешение. Гель получают полимеризацией акриламида в присутствии метиленбисакриламида или других соединений, служащих сшивающими агентами. В работе Сарджента [3] подробно описаны способ получения гелей, процедура нанесения пробы и условия разделения. [c.138]

Ригетти и Дрисдейл [103] исследовали возможность разделения нуклеотидов методом изоэлектрической фокусировки на полиамиде. Катон и Гольдштейн [104] провели электрофоретическое разделение РНК на геле полиакриламида с линейным градиентом от 2,5 до 12 % На одном и том же геле можно разделить с хорошим разрешением все РНК от 4S до 28S. Джеппезен [105] использовал линейные градиенты от 3,5 до 7,5 % и от 2,5 до 7,5 % для разделения фрагментов ДНК. Полученные полосы были более четкими, чем при обычном электрофорезе на слоях геля. [c.136]

Меченые РНК выделяли из очищенных стан-.лартных и ди вирусных частиц и анализировали методом электрофореза в слошном геле PRi PRO (полиакриламида 2,2%, агарозы 0,6% и мочеви-ны 6М) в течение 23 ч при 180 В и 4 °С [23]. РД [c.251]

Халук и др. [72] использовали целлюлозу, силикагель, полиамид и гель полиакриламида в качестве субстратов при электрофорезе 25 фенольных кислот. Буферным раствором для полиакриламида служила смесь пиридин—уксусная кислота— вода (5 2 493) (pH 5,3) напряжение составляло 1400 В и сила тока 40 мА. На силикагеле и полиамиде проводили двумерное разделение хроматографию в одном направлении и электрофорез во втором. Для разделения соединений ряда бензойной кислоты применяли смесь этилацетат—уксусная кислота (95 5) при хроматографировании на полиамиде и буферный раствор Аронссона (pH 8,9) при электрофорезе при напряжении 1800 В и токе 40 мА для соединений ряда коричной кислоты буферным раствором служила смесь пиридин—уксусная кислота—вода (1 6 90) (pH 3,55) при токе в 20 мА (об условиях разделения на целлюлозе см. в разд. 5 этой главы). Уокер и Томпсон [86] также пользовались целлюлозой в качестве неподвижной фазы для электрофореза фенолов с буферными растворами с pH 5,3 или 9,1 при напряженности поля 60 В/см. Чтобы улучшить разрешение, под прямым углом к направлению электрофореза проводили хроматографирование. [c.251]

Другой тип электрофореза осуществляется в поддерживающих средах, например в гелях (крахмал, агар-агар, полиакриламид), что значительно повышает разрешающую силу электрофоретического анализа и позволяет работать с малыми количествами веществ. В качестве примера можно привести разделение препарата фетуина в геле. По данным ультрацентрифугирования и иммуноэлектрофореза этот препарат гомогенен, однако при электрофорезе на поливинилхлориде при pH 8 он разделяется на несколько фракций, отличающихся содержанием сиаловых кислот. Такое же тонкое разделение этого препарата удалось достичь на ДЭАЭ-сефадексе. Следует отметить, что хроматография на колонках и гель-фильтрация дают достаточно полное представление о гомогенности и широко применяются в практике. [c.74]

Рис. 9. Прибор для электрофореза в градиенте) плотности в начале электрофоретического разделения [985]. А, Л-образная трубка. Б. Составные части поршня. 1 — аппарат для создания градиента плотности 2 — двухходовой кран 5 —трехходовой кран — пластмассовый шприц для вне сения пробы 5 — пропускание воздуха для перемешивания раствора при формировании градиента 6 — ось редуктора, понижающего число оборотов мотора 7—нитка 8 — анодная платиновая спираль Р —градиент —поршень /7 —проба в выбранном положении /2 — насыщенный раствор сахарозы 75 —пробка из полиакриламидного геля 74 — насыщенный раствор хлористого натрия /5 — катод 75 —водяная рубашка для термостатировання 77—пластмассовая трубка 75 —зубчатая насечка 7Р —пробка из полиакриламида или агарозы 20 — уплотнительное кольцо 21 — наконечник для присоединения пластмассовой трубки.

Электрофоретическая подвижность двухцепочечных ДНК в полиакриламидном или агарозном геле пропорциональна логарифму их молекулярной массы [107]. По вышеизложенным причинам это соотношение справедливо лишь в случае фрагментов со сравнительно низкой молекулярной массой. Для электрофореза обычно используют трис-буфер с низкой ионной силой, доведенный до pH 7—8 путем добавления NaH2P04, борной или уксусной кислоты [107]. Выбор геля определяется размерами фрагментов, которые необходимо разделить. Электрофоретическое разделение фрагментов, содержащих менее 400 пар нуклеотидов, проводят в 2—10%-ных полиакриламидных гелях, фрагменты длиной в 400—1000 пар нуклеотидов разделяют в комбинированных полиакриламид-агарозных гелях, а более длинные фрагменты —в 0,5—1,0%-ных агарозных гелях [107]. Соединения, существенно различающиеся по молекулярной массе, можно разделить в градиенте концентрации полиакриламидного геля [106]. [c.184]

При применении этого метода наносят очень небольшие количества концентрированного раствора исследуемого препарата на старт в виде узкой полосы. В результате электрофореза (может быть приложена весьма высокая разность потенциалов, поскольку в геле подавляются конвекционные токи) смесь будет разделяться на ряд зон, что позволяет получить более высокое разрешение, чем при работе по методу свободной границы. Более того, можно варьировать средний размер пор и распределение пор по размерам для некоторых поддерживаюш,их сред (крахмал, агар, полиакриламид) таким образом, что действие одного из факторов, влияюш их на электрофоретическую подвижность, а именно гидродинамического сопротивления, будет столь велико, что часть молекул будет практически неподвижной [30]. Электрофоретические подвижности в гелях или на бумаге нельзя непосредственно сравнивать с электрофоретическими подвижностями, измеренными методом свободной границы, кроме тех случаев, когда рассматриваемые молекулы малы по сравнению с размерами пор в поддерживающей среде. Компактные белки с молекулярным весом вплоть до 50 ООО легко диффундируют в 5%-ном полиакриламидном геле, и даже с веществами большего молекулярного веса можно получить хорошие результаты. Бумагу или гелевый блок нужно окрасить, чтобы показать положение различных компонентов можно также сделать перенос на подходящим образом вырезанный кусок фильтровальной бумаги, хотя эта методика часто малочувствительна. Обычные красители, применяемые для обнаружения белков (нигрозин, амидовый черный), дают удовлетворительные результаты для многих гликонротеинов, но некоторые эпителиальные вещества, которые могут представлять собой по существу углеводы (до 90%), окрашиваются довольно плохо. Было найдено, что для кислых гликонротеинов лучше применять толуидиновый голубой [32] или муцикармин [33], а алциановый голубой окрашивает как кислые, так и нейтральные гликопротеины [34]. Наиболее общей методикой окрашивания является, по опыту автора, методика Райдона и Смита [35] (хлорирование и обработка смесью крахмала и иодистого калия), но она неприменима на полиакриламидных гелях. [c.47]

Приборы и методы, используемые при изучении генетической изменчивости в природных популяциях с помощью электрофореза в геле, изображены на рис. 22.7. Образцы тканей разных организмов гомогенизируют (измельчают) для освобождения из клеток ферментов и других белков. Пробы надосадочных жидкостей (растворимых фракций), полученных при центрифугировании гомоге-натов, наносят на гель, приготовленный из крахмала, агара, полиакриламида или какого-нибудь другого желеобразного [c.86]

Рис. 22.12. Изменение электрофоретической подвижности белков как функция концентрации геля. Изображены графики для пяти белков, кодируемых пятью различными аллелями локуса 0,-Gpdh бабочки olias eurytheme. Электрофорез можно выполнять в гелях с различной концентрацией полиакриламида. При концентрации 5%, подвижности всех

Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промывать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше-гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммония. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет 30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей — полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев. [c.158]

Электрофорез проводят либо в цилиндрических колонках, заполненных гелем (в стеклянных трубках), либо на пластинках размерами 10ХЮ см, покрытых слоем геля толщиной 1—4 мм. Гель состоит из трех слоев внизу располагается разделяющий гель, в середине — концентрирующий (гель-прокладка) и вверху — стартовый гель, содержащий образец. Каждый слой представляет собой полиакриламид с определенной степенью сшивки. Гель образуется в трубке или на пластинке из раствора, содержащего акриламид (мономер), М,М -ме-тиленбисакриламид (БИС), буфер, сшивающий и поли-меризующий агенты. Полимеризацию катализируют либо химическим способом, используя персульфат аммония, либо фотохимическим — с помощью света, который вызывает образование свободных радикалов в присутствии кислорода. [c.259]

Изоэлектрическое фокусирование применяется как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. Для аналитических целей используют методики, очень сходные с диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом полиакриламид с низкой степенью сшивки служит в качестве антиконвекционной среды. Для препаративного разделения можно использовать готовое оборудование или изготовить его самим. [c.276]

Зонный электрофорез предполагает использование неподвижного носителя, по поверхности или через объем которого осуществляется миграция ионов. Носители могут применяться в виде полос (например, бумаги), колонок, дисков, тонких слоев и т. д. Для зонного электрофореза чаще всего используют фильтровальные бумаги (Ватман № 1 и № ЗММ), а также ацетат целлюлозы, гели агара, крахмала и полиакриламида 24, 25]. Электрофорез осуществляется под действием электрических полей низкого (<1000 В) и высокого (от 1000 до 10000 В) напряжения. При непрерывном электрофорезе (препаративный метод с использованием низкого напряжении) образец непрерывно подается на носитель (чаще всего бумага Ватман № ЗММ или Шлейхер-Шюлль 2230). Электрофорез с высоким напряжением электрического поля проводят, как правило, на бумаге этот метод дает хорошие результаты при анализе аминокислот и других небольших молекул и непригоден для анализа больших молекул. [c.403]

Еще один вариант препаратив- юго электрофореза в полиакриламидном геле со стоит в том, что макромолекулы, мигрирующие через полиакриламид, переходят в раствор градиента плотности сахарозы, который после окончания электрофореза фракционируют. Из полученных фракций можно легко выделить нужные компоненты [1150, 1160]/ [c.122]

В данном методе используют эффект молекулярного сита, свойственный полиакриламидным гелям различной концентрации. Чтобы улучшить разрешение, рекомендуется на первом этапе проводить электрофорез в геле с низкой концентрацией полиакриламида, а на втором — электрофорез в градиенте концентрации полиакриламида. Такие системы были применены при разделении белков сыворотки крови [821, 1452]. Марголис и Кенрик 821] для электрофореза в первом направлении использовали 2,7%-ный гель, а Райт [1452]—4,75%-ный. Электрофорез во втором направлении проводили в градиенте концентрации 4—20%-ного 1[821] или 2—30%-ного [1452] полиакриламида. Применение в первом направлении 2,7%-ного полиакриламидного геля [821] улучшало разделение белков с большой молекулярной массой, тогда как при электрофорезе во втором направлении разделение было лучше при использовании более крутого градиента [1452]. Об эффективности указанных методов свидетельствует то, что при разделении с их помощью белков сыворотки человека на электрофореграмме было обнаружено более ста зон [1452]. [c.229]

Вскоре после первых сообщений об ИЭФ в геле этот метод в сочетании с электрофорезом был использован для разделения бел ков сыворотки крови [269, 270] и пероксидаз из сока клубней картофеля [794]. Электрофорез во втором направлении можно проводить не в полиакриламидном, а в крахмальном геле, [1460]. Кенрик и Марголис [670] применили для разделения белков сыворотки крови сочетание ИЭФ с электрофорезом в градиенте концентрации полиакриламида. Разделение в 1-м направлении они проводили в градиенте pH 3—10, а во 2-м — в градиенте концентрации геля вогнутой формы (4,5—26% Т)- [c.232]

Миро и др. [876] применяли гели с экспоненциальным градиентом концентрации полиакриламида, приготовленные в кварцевых трубках. Это дало возможность проводить прямое денситометрическое сканирование гелей. Чтобы обеспечить стабильность градиента концентрации акриламида во время полимеризации, создавали параллельный градиент концентрации глицерина. ТЕМЭД и персульфат добавляли в концентрациях обратно пропорциональных концентрации акриламида. Гели готовили на буфере, содержащем триэтаноламин, ацетат натрия и ЭДТА (pH 7,4). Электродные резервуары наполняли тем же буфером с добавлением глицерина, ДСН и дезоксихолата. Ядрышковые РНК из клеток НеЬа наносили на гель в объеме 50 и 800 мкл. Если электрофорез продолжался в течение 9 ч, то разделение было лучше в пробе с объемом 50 мкл, однако через 18 ч в обоих случаях были получены одинаково хорошие результаты (рис. 121). Изучение кинетики электрофоретической миграции показало, что в градиентном геле разные виды РНК движутся с той же относительной скоростью, что и в однородном геле. При использовании экспоненциального градиента концентрации от 1,8 до 15% можно в один прием разделить все клеточные РНК и определить их молекулярные массы. [c.379]

Недавно описана усовершенствованная методика препарати вного электрофореза рибосомных РНК на пластинах геля, содержащего 0,5% агарозы и 2,4% полиакриламида [c.387]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология