Ник-трансляция

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как Р или Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК [c.308]

Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т.п.н., клонированного на фаговом векторе. Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент ДНК, радиоактивно меченный ( Н) с помощью ник-трансляции. Пред- [c.314]

Проведите ник-трансляцию примерно 0,5 мкг ДНК (методика 22). [c.47]

Внесение метки а- Р в ДНК с помощью ник-трансляции [c.121]

Объемы приведены из расчета, что реакцию проводят в 25 мкл. Буфер для ник-трансляции [c.121]

Внесение метки в а- Р ДНК с помощью ник-трансляции 123 [c.123]

Мечение с использованием в качестве затравки олигонуклеотидов [2] позволяет получить комплементарные пробы ДНК, обладающие высокой радиоактивностью, и представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с методом ник-трансляции. Принцип усовершенствования состоит в использовании в качестве субстрата при мечении очищенного фрагмента ДНК что удобно в нескольких отношениях [c.297]

С помощью этого метода можно получить до 1 мг высоко-очищенных плазмид. Малые РНК (такие как тРН К), которые являются единственными примесями в таких препаратах, устраняются на дальнейших этапах очистки (этап 12). Однако все ферментативные реакции с этими препаратами (гидролиз рестриктазами, ник-трансляция, реакция с ферментом Кленова, лигирование и т. д.) протекают столь же эффективно, как и в случае плазмид, очищенных с помощью градиента хлористого цезия. Далее фрагменты рестрикции ДНК можно очищать в низкоплавкой агарозе или полиакриламидных гелях без каких-либо сложностей. [c.78]

Рис. 13.8. Синтез in vitro радиоактивной цепи ДНК (цветная линия) при действии ДНК-полимеразы I. Совместное действие полимеризационного и экзонуклеазного центров (см. рис. 13.7) приводит к перемещению одноцепочечного 3 -ОН/5 -РО -разрыва вокруг показанной на рисунке кольцевой матричной цепи. Поэтому данный процесс называется ник-трансляцией (т.е. перемещением разрыва).

Примечание Фрагменты ДНК, полученные с помощью этого метода, не содержат ингибирующих примесей, и их можно использовать во всех ферментативных реакциях (например, в реакциях лигирования, ник-трансляции и т. д.). [c.81]

ДНК-полимераза I проявляет уникальную способность инициировать репликацию in vitro в месте разреза ДНК. В точке, где разрушена фосфодиэфирная связь в двухцепочечной ДНК, фермент удлиняет З -ОН-конец. Когда новый сегмент ДНК синтезирован, он замещает существующую гомологичную цепь в двойной цепи. Такой процесс смещения разрыва показан на рис. 32.9. Замещаемая цепь деградирует с помощью 5 —З -экзонуклеолитической активности фермента. В результате сохраняется ДНК с неизменными свойствами, за исключением того сегмента ДНК, который был замещен вновь синтезированным материалом, где положение разрыва оказалось сдвинутым по длине двойной цепи. Такой эффект имеет большое практическое значение, так как именно он позволяет внедрить в ДНК in vitro радиоактивно меченные нуклеотиды. Смещение разрыва (ник-трансляция) -это основной метод, используемый для получения радиоактивно меченной ДНК. [c.415]

ВВЕДЕНИЕ МЕТКИ В ДНК ПРИ СМЕЩЕНИИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО РАЗРЫВА (ник-ТРАНСЛЯЦИЯ). Способность ДНК-по-лимеразы I Е. соН использовать разрыв в одной из цепей ДНК для того, чтобы начиная с него последовательно осуществить деградацию этой цепи, одновременно заменяя ее новосинтеризи-рованной используется для введения в ДНК радиоактивно меченных нуклеотидов in vitro, [c.520]

ДНК-полимераза I (или Pol I) Е. oli находит широкое применение в работе с рекомбинантными ДНК и при определении нуклеотидной последовательности ДНК. Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением радиоактивной метки в ДНК in vitro с помошью так называемой ник-трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полимеразной и 5 З -экзонуклеазной активностей. Этот процесс позволяет добиться необычайно высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т. е. получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью (оцениваемой в импульсах в минуту на 1 мкг ДНК), чем при введении метки in vivo. Радиоактивные ДНК-зонды, полученные с помощью ник-транс- [c.113]

Экспериментальные данные о процессах перегруппировки генов, кодирующих константные и вариабельные участки иммуноглобулиновых цепей, были получены с помощью методов, основанных на применении рекомбинантных ДНК. Для этого из фракции полисом выделяли мРНК, кодирующую L-цепь миеломы, на ее основе с помощью обратной транскриптазы получали кДНК, которую клонировали на плазмид-ном векторе. Наработанную в значительных количествах клонированную кДНК расщепляли подходящей рестриктазой таким образом, чтобы получить два фрагмента, соответствующих V- и С-участкам L-цепи. Фрагменты ДНК разделяли препаративно с помощью электрофореза, вводили радиоактивную метку с помощью ник-трансляции, денатурировали и использовали в качестве зондов для идентификации фрагментов рестрикции ДНК из миеломных или эмбриональных клеток, содержащих последовательности, комплементарные последовательностям зондов. Наиболее существенно, что, как показано на рис. 16.22, в ДНК клеток миеломы оба V- и С-кодирующих участка локализуются на одном и том же со RI-фрагменте, в то время как в эмбриональной ДНК они находятся на различных Есо RI-фрагментах. Это означает, что на каком-то этапе развития между эмбриональной клеткой и дифференцированным лимфоцитом происходит специфическая перестройка ДНК, которая в данном случае привела к удалению Есо RI-сайта (или сайтов), находившегося в рамках протяженной области ДНК между V- и С-ко-дирующим участками в эмбриональной ДНК. После такой перестройки эти участки оказались расположенными в непосредственной близости друг к другу. Комбинация генов L-цепи, возникшая при их перегруппировке в ходе дифференциации лимфоцита, при его последующем митотическом делении устойчиво наследуется дочерними клетками. [c.241]

Ник-трансляция (смещение разрыва). Способ введения меченых трифосфатов в нативную ДНК in vitro, с помоидью ДНК-полимеразы I Е. соН. При этом используется 5 -Р04/3 -0Н-разрыв только в одной из двух цепей нативной молекулы ДНК ДНК-полимераза I катализирует удаление 5 -Р04 концевого нуклеотида и добавление экзогенного меченого нуклеотида к З -ОН группе. В результате удаления и достройки нуклеотида происходит смещение разрыва на один нуклеотид. Последующие циклы удаления и полимеризации смещают разрыв вдоль молекулы ДНК, при этом среди замещенных нуклеотидов появляется все больше меченых. [c.311]

Другим способом введения метки в ДНК in vitro, который находит все более широкое применение, является ник-трансляция [15, 37, 48, 50]. В этом случае сначала ДНК инкубируют с панкреатической ДНКазой I, под действием которой в ДНК образуются одноцепочечные разрывы. Затем ДНКазу инактивируют, а ДНК инкубируют с полимеразой I Е. oli и натриевыми солями четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (один из которых является радиоактивным, обычно с меткой Н). [c.135]

РНК-зонды обладают всеми преимуществами одноцепочечных ДНК-зондов это отсутствие конкурентной гибридизации молекул зонда друг с другом, высокая удельная радиоактивность по сравнению с продуктом ник-трансляции и не представляющее трудностей определение длины молекул. Дополнительное преимущество этих зондов по сравнению с одноцепочечной ДНК — большая простота их получения. Транскрипты можно отделить от матрицы путем ее ДНКазного расщепления и фенольной экстракции, тогда как получение одноцепочечных ДНК-зондов требует более трудоемкой процедуры выделения их из геля. В то же время РНК-зонды в большей степени подвержены деградации, чем соответствующие им ДНК-зонды, и об этом нельзя забывать. Самая распространенная проблема, встающая при использовании РНК-зондов, — неоднозначность интерпретации в случае получения отрицательного результата. [c.13]

Синтез двухцепочечной кДНК ник-трансляция Ник-трансляция, картирование гиперчувстви-тельных участков в ДНК Секвенирование ДНК, картирование ДНК-белковых взаимодействий Секвенирование ДНК Введение в ДНК и РНК [c.39]

Липкие концы ДНК. Комплементарные одноцепочечные участки ДНК, выступающие на противоположных концах двухцепочечной молекулы. Ник-трансляция. Метод введения метки в ДНК основан на том, что ДНК-полимераза Es heri hia oli способна осуществлять деградацию одной из цепей ДНК, в которой до этого был сделан разрез ( ник ), и тут же строить новую цепь, используя неповрежденную в качестве матрицы. Если в реакционную смесь ввести меченые нуклеозидтрифосфаты, то вновь образуемая цепь окажется радиоактивной, что дает возможность ее использования в качестве зонда. [c.51]

В бляшке фага % содержится много фага и фаговой ДНК. Фаг и ДНК можно прямо из бляшек перенести на нитроцеллюлозу, если наложить на чашку сухой нитроцеллюлозный фильтр. После денатурации перенесенной на фильтр ДНК она оказывается уже готовой для гибридизации. Таким способом можно проверять до 25 ООО бляшек на одной чашке. Связанную с фильтрами денатурированную ДНК гибридизуют с ДНК, меченной Р с помощью ник-трансляции. После этого фильтр промывают и экспонируют с ним рентгеновскую пленку. Пятна почернения на пленке соответствуют гибридизующимся клонам. [c.46]

Основная методическая трудность — это сориентировать рентгеновскую пленку относительно чашки. Для этого мы пользуемся специальным ориентирующим фагом. Этот фаг содержит фрагмент ДНК, способный гибридизоваться с определенной меченной ник-трансляцией ДНК (pBR322), а также несет ген [c.46]

Ник-трансляция — процедура довольно длительная, и начинать ее следует как можно раньше. Обязательно наденьте фартук для работы с радиоактивностью, халат, заи итные очки и двойные перчатки. Пользуясь ручным счетчиком, постоянно проверяйте, нет ли загрязнения радиоактивностью (см. методику 22). Необходимо заранее запастись ф-СТР или другим меченным з Р дезоксирибонуклеозидтрифосфатом, ДНКазой I, дезо-ксирибонуклеозидтрифосфатами, а также буфером 10XNT, останавливающим раствором и буфером ТЕ. [c.49]

Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу. После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК, меченной с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, мол<но определить размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной ДНК-зонду. [c.50]

В полипропиленовую пробирку внесите зонд (меченный или с помощью ник-трансляции), растворенный в буфере ТЕ [10 мМ трис (pH 7,5), 1 мМ Маз-ЭДТА). Используйте зонд в количестве, соответствующем примерно 10 —5-10 расп./мин. [c.125]

ВОК или методами ник-трансляции. В этом случае следует воспользоваться техникой достройки праймера (табл. 2, рис. 1). По этой методике синтетический олигонуклеотид, комплементарный последовательности, находящ,ейся со стороны З -конца минисателлитной вставки, отжигается на матрице в растворе. В результате чего появляются З -гидроксильные группы, к которым большой фрагмент ДНК-полимеразы I может присоединить меченые дезоксирибонуклеозиды. По истечении времени, необходимого для синтеза комплементарной цепи по всей длине вставки, можно использовать рестриктазу для расщепления новой двухцвпочечной молекулы у 5 -конца вставки. Если две [c.195]

Мечение происходит весьма эффективно, и, таким образом, в отличие от ник-трансляции нет необходи1Мости избавляться от Ф-d TP перед внесением ДНК-пробы в гибридизационную смесь. Хотя реакция хорошо воспроизводится, часто необходимо измерить включение P-d TP в ДНК-пробу, как оппсано в приложении 5 [III]. В результате удельная активность превышает 10 имп/мин/мкг. [c.301]

Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма разрушают тем или иным способом (см. 8.1), выделяют ДНК, фрагментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300—350 пар оснований (определяется электрофорезом в 1%-ной агарозе), денатурируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильтрах, ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вводят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нукле-озид-5 -трифосфата при одновременном действии ДНКазы 1 и ДНК полимеразы 1 Е. oli и используют для гибридизации. Ее чаще всего проводят по методу Денхардта в 20%-ном формамиде при 62° в течение 18—24 ч ( мягкая ренатурация ), отмывают от несвязавшейся меченой ДНК, и радиоактивность фильтров просчитывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологичных ДНК принимают за 100% и рассчитывают проценты связанной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент связанной ДНК отражает степень гомологии молекул и служит показателем родства штаммов. Аналогичная реассоциация может быть осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двойные спирали образуются также между одноцепочечными ДНК и комплементарными цепями РНК. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Герхард и др,, 1984). [c.146]

При использовании в качестве предшественника одного из нуклеотидов, меченного можно получить зонды с удельной радиоактивностью 10 распад./мин на 1 мкг в системе с обратной транскриптазой или 3-10 распад./мин на 1 мкг в системе ник-трансляции. Эти удельные активности пропорционально увеличиваются при использовании двух или трех меченых предшественников, но, когда используются все четыре предшественника, меченные происходит снижение активности обратной транскриптазы и системы ник-трансляции. При ник-трансляции с использованием 1-дезоксицитидина (уд. активность выше 1500 Ки/моль Amersham или NEN) без носителя удается в настоящее время получить зонды с удельной активностью 10 распад./мин на 1 мкг и выше. [c.306]

Для гибридизации используют зонды, полученные с помощью ник-трансляции (Maniatis et al., 1982) (удельная активность 10 —10 имп/(мин-мкг), и ДНК-конкурент (см. ниже). ДНК денатурируют путем инкубации в кипящей водяной бане или в нагревательном блоке (95 °С) в течение 5 мин и последующего быстрого охлаждения в смеси воды и льда в течение 1—2 мин. 1 мл гибридизационного раствора содержит от 10 до 10 имп/мин. Одновременно можно пользоваться несколькими зондами, однако общая радиоактивность в растворе для гибридизации не должна превышать 10 ими/(мин-мл), чтобы не возникало проблем, связанных с высоким фоном. [c.28]

Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (1990) -- [ c.48 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.48 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.51 ]

Генетика человека Т.3 (1990) -- [ c.130 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.51 ]

Вирусология Методы (1988) -- [ c.30 , c.31 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.63 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.78 , c.79 , c.88 , c.222 ]

Биосенсоры основы и приложения (1991) -- [ c.68 ]

Генетическая инженерия (2004) -- [ c.24 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология