Эндонуклеаза рестрикционная

Таблица 9.1. Последовательности, узнаваемые некоторыми рестрикционными эндонуклеазами

Рестрикционные эндонуклеазы первого класса узнают специфическую последовательность ДНК, но расщепляют нуклеиновую кислоту в различных местах, находящихся на неопределенном расстоянии от участка узнавания. Они содержат в одном ферментном комплексе рестриктирующую и модифицирующую активности и требуют присутствия в среде S-аденозилметионина, АТР и Mg +. [c.309]

Для двухцепочечных ДНК перекрывающиеся блоки получаются путем расщепления двумя или более различными рестрикционными эндонуклеазами. При этом часть исследуемой ДНК гидролизуется одним ферментом и устанавливается структура полученных фраг- [c.314]

Молекула вектора должна отвечать определенным требованиям быть небольшой, содержать уникальные участки расщепления рестрикционными эндонуклеазами, иметь маркеры для оптимальной селекции рекомбинантных клеток. В качестве векторов для включения чужеродной ДНК в клетки Е. соИ используются плазмиды (термин предложен Дж. Ледербергом) и бактериофаги. И те и другие являются репликонами. [c.430]

Разрезание ДНК на фрагменты Любая нативная ДНК может быть "измельчена" с помощью ферментов эндонуклеаз, среди которых особое место занимает рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы) Биологическая роль их, например, в клетках прокариот заключается в гидролизе чужеродной ДНК, проникающей в клетки извне Собственная хромосомная ДНК при этом остается незатронутой рестриктазами, что обусловлено наличием ферментов, называемых моди-фикационными мети-лазами, узнающими одинаковые с рестриктазами сайты Названные метилазы катализируют реакции метилирования А или Ц в немногих специфических сайтах в хромосомах, в результате чего метилированная ДНК оказывается нечувствительной к атаке рестриктазами Переносчиком метильных групп выступает S-адено-зил-Ь-метионин (SAM) [c.188]

Рестрикционные эндонуклеазы — важнейший "инструмент" для выполнения генно-инженерных работ. Часть производимых рестриктаз приведена в таблице 20. [c.460]

Серия Биологическая химия . Том 11 Регуляция транскрипции у бактерий. Микротрубочки, их структура, химия и функциональная роль. Особенности биотрансформации и распределения психотропных средств с нейролептическим и антидепрессивным действием. Том 12 Липидные модели биологических мембран. Том 13 Молекулярная биология онкогенных вирусов. Том 14 Рестрикционные эндонуклеазы в генной инженерии. [c.85]

В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. соИ, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами — рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются около 200. [c.25]

ЛИНКЕР. Синтетический, короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестрикционных эндонуклеаз может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью какой-либо другой рестриктирующей эндонуклеазы, в процессе реконструирования рекомбинантной ДНК. [c.523]

Рис. 15.21. Получение гибридной ДНК путем вставки фрагмента эукариотической ДНК в бактериальную плазмиду (упрощенная схема). Чужеродную ДНК и ДНК плазмиды расщепляют in vitro с помощью одной и той же рестрикционной эндонуклеазы. При этом получаются фрагменты с липкими концами (одноцепочечными концевыми участками с комплементарными основаниями). В результате смешивания таких фрагментов и обработки лигазой образуются плазмиды с включенной в них эукариотической ДНК. Эти гибридные ДНК можно вводить в подходящие бактерии и размножать, получая массовые культуры трансформированных клонов. Из такого клона удается выделить чужеродную ДНК.

Препарат кольцевой плазмидной ДНК длиной 18 т. п. н подвергают полной рестрикции эндонуклеазой Кш I. Электрофорез в геле выявляет наличие фрагментов следующих размеров 5,0 4,0 3,5 3,0 1,5 и 1,0. Неполная рестрикция интактной плазмидной ДНК той же эндонуклеазой с последующим разделением фрагментов посредством электрофореза в геле показывает существование пяти фрагментов, обозначенных в порядке убывания размеров буквами от А до Е. Результаты последующей полной рестрикции этих фрагментов представлены в таблице. Постройте рестрикционную карту кольцевой плазмидной ДНК. [c.292]

Недостаточно обоснованные выводы о встречаемости нуклеозидов могут оказаться некорректными. Так, помимо восьми основных нуклеозидов (1) — (8), большинство классов нуклеиновых кислот, столь сильно различающихся между собой, содержат, как было показано, в большем или меньшем процентном отношении модифицированные нуклеозиды. Длительное время было известно, что 5-метилдезоксицитидин образуется в гидролизатах ДНК растений и животных [7] полагают, что каждая система ферментов рестрикции бактерий содержит метилазу, которая метилирует специфические остатки оснований ДНК хозяина в последовательности, узнаваемой рестрикционной эндонуклеазой [7], давая таким образом появление модифицированных нуклеозидов из бактериальной ДНК. Фаговые ДНК часто содержат большие количества модифицированных нуклеозидов и очень возможно, что нас еще ожидает много неожиданностей по мере определения состава нуклеи новых кислот других фагов [7]. [c.70]

Рестрикционные нуклеазы. являются бактериальными эндонуклеазами, которые узнают специфическую последовательность оснований, обычно от четырех до шести остатков длиной, обладающую центром симметрии [27]. Фермент действует таким образом, что разрывает обе цепи симметрично по отнощению к этому центру (табл. 22.4.1). Состав различных узнаваемых последовательностей регулирует частоту, с которой они появляются в больщих молекулах ДНК- Напрнмер, E o R1, из Е. соИ делает один разрыв в молекуле ДНК вируса % (5000 пар нуклеотидов), тогда как Мае 11 , из Haemophilus aegyptius расщепляет ту же ДНК в 17 местах. [c.192]

Таким образом, появился метод специфических расщеплений молекул ДНК, который состааил основу современной методологии установления структуры нуклеиновых кислот и генной инженерии. Исследования рестрикционных эндонуклеаз были отмечены Нобелевской премией, присужденной X. Смиту, В. Арберу и Д. На-тансу. [c.297]

В 1972 г. П. Берг сообщил о соединении in vitro, с помощью специально разработанных приемов, ДНК двух различных вирусов бактериофага X и SV-40. Таким образом, было положено начало генетической инженерии, которая вскоре стала использовать для получения фрагментов ДНК рестрикционные эндонуклеазы, а для [c.297]

Однако наиболее широкое применение находят сравнительно короткие олигонуклеотиды. Для того чтобы придать фрагменту нуклеиновой кислоты необходимые для встраивания в определенный участок векторной молекулы липкие концы, синтезируются так называемые линкеры, т. е. двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие последовательность, расщепляемую той или иной рестрикционной эндонуклеазой. Обычно в качестве линкеров применяются самокомплементарные олигонуклеотиды длиной 8—10 нуклеотидных звеньев. На рисунке 213 демонстрируются некоторые типы линкеров. [c.377]

ИХ соединения открытые и хорошо охарактеризованные к тому времени ферменты — ДНК-лигазы. Были разработаны (Г. Бойер, С. Коэн. Д. Хелинский) системы введения чужеродных ДНК в различные клетки, которые использовали в качестве носителя ДНК вне хромосомные элементы, способные существовать и размножаться в этих клетках, зачастую вместе с ним. Встраивание чужой ДНК в носители (векторы) осуществлялось путем разрезания их рестрикционными эндонуклеазами и последующего сшивания лигазами. [c.298]

Эти ферменты являются компонентами системы рестрикции — модификации прокариотических клеток, которая предназначена для их защиты от чужеродных ДНК. К рестрикционным эндонуклеазам относятся также и все другие ферменты, специфически расщепляющие ДНК по определенной последовательности, хотя часто их роль в процессах рестрикции — модификации не доказана. В зависимости от характера узнаваемой нуклеотидной последовательности ( сайта ), мест расщепления и условий реакции ре-стриктазы делятся на три класса. [c.309]

Системы модификации и рестрикции были открыты благодаря их действию в отношении инфицирующей фаговой ДНК. Фаговая ДНК, выделяемая из бактерии, может успешно инфицировать другую бактерию того же штамма, поскольку обе клетки имеют один и тот же тип модификации. Однако фаговая ДНК, которая переходит из одного штамма в другой, атакуется рестрикционными эндонуклеазами. Следовательно, фаг ограничен (restri ted) одним бактериальным штаммом, отсюда и появился термин рестрикция . Следует отметить, что рестрикция не обязательна. Некоторые инфицирующие фаги избегают ее, что обусловлено либо мутациями в сайтах-мишенях, либо неточной раВотой системы клетки-хозяина. В этом случае они приобретают тип модификации нового хозяина. [c.432]

Фрагменты ДНК условно обозначены прямоугольниками, верхняя сторона которых представляет собой одну комплементарную цепь, а нижняя сторона — другую. Слева указаны эндонуклеазы, использованные для получения перекрывающихся блоков. Вверху длна рестрикционная карта определяемого фрагмента. Стрелками в прямоугольниках указывается длина расшифрованного участка и направление, в котором определялась последовательность (в данном случае она определялась в направлении от 5 - к З -концу). [c.315]

Неполные расщепления используются и в случае установления последоаательности ДНК. Для этой цели может быть применена обработка как рестрикционными эндонуклеазами, так и неспецифичными эндонуклеазами (иапример, ДНазой I в присутствии ионов Мп ). [c.316]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с )гчетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, метилирования (модификации) и посадки соответственно К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S), ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — RS и MS Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеуказанных трех групп, преимущественно использзшэтся на практике Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы Отдельные из них, например, не узнают сайтов посадки Их редко используют на практике [c.189]

У разных видов бактерий обнаружено уже свыше 150 различных рестриктирующих эндонуклеаз. Некоторые бактерии содержат больше одного набора модифицирующих метилаз и рестриктирующих эндонуклеаз. Однако ДНК вирусов бактерий научились с помощью ряда способов преодолевать рестрикционную защиту клеток их хозяев. Некоторые вирусные ДНК содержат разного рода модифицированные основания, которые позволяют им избегать расщепления ре-стриктирующими эндонуклеазами клетки-хозяина, в которую они попали. Модифицирующими группами в таких вирусных ДНК служат метильные, ги-дрокСиметильные и глюкозильные группы. Другие вирусы в ходе эволюции приобрели такие последовательности в ДНК, которые не содержат участков, узнаваемых некоторыми рестриктирую-щими эндонуклеазами. [c.881]

Очевидно, что бактериальная клетка должна как-то защищать свою ДНК от воздействия собственной рестрикционной эндонуклеазы. Такую защиту обеспечивает метилирование или глюкозилирование определенных оснований ДНК, обычно аденина или цитозина. Этот процесс известен под названием модификации. Из него извлекают пользу также и фаги, размножающиеся в клетках определенного штамма бактерий. На фаговую ДНК при ее синтезе в клетках данного типа накладывается тот же отпечаток , что и на ДНК самой клетки в присутствии модифицирующего фермента фаговая ДНК видоизменяется таким же образом, как и ДНК хозяина. Она так же метилируется и приобретает свойства, запщщающие ее от воздействия рестрикционных ферментов данного штамма бактерий. [c.468]

Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Подробно мы анализировали реакцию разрезания при обсуждении перспектив ее использования для картирования или реконструирования ДНК in vitro (гл. 3 и 19). Теперь мы рассмотрим вопрос о том, как выполняют эти ферменты свои природные функции. [c.432]

Смотреть страницы где упоминается термин Эндонуклеаза рестрикционная: [c.214] [c.214] [c.167] [c.472] [c.309] [c.311] [c.313] [c.315] [c.372] [c.378] [c.428] [c.436] [c.156] [c.190] [c.194] [c.37] [c.468] [c.468] [c.469] [c.219] [c.30] [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология