Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

Рис. 5.18. Первый раунд ПЦР. ДНК-мишень фланкирована последовательностями Г—2 в одной цепи и последовательностями 1—2 — в другой. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу и четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP). Смесь нагревают до 95 С, инкубируют в течение 1 мин и медленно охлаждают до 55 °С. При этой температуре праймеры, добавленные в избытке, спариваются с разделенными цепями. Повышают температуру до 75 °С. В этих условиях происходит синтез обеих цепей ДНК, начинаюший-ся с 3 -гидроксильных концов праймеров. Каждая из синтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3 -гидроксильной группы ее праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Эти цепи служат матрицами во втором раунде ПЦР.

ДНК-полимераза удлиняет эту цепь РНК, используя для синтеза ре-лликационных фрагментов дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Синтез происходит вдоль обеих цепей в направлениях, указанных в уравнении (15-3). В дальнейшем затравочные РНК-концы отщепляются. Бреши в синтезированной цепи заполняются за счет дальнейшей работы полимеразы, а надрезы сшиваются под действием лигазы. Согласно этому механизму, одна цепь может синтезироваться непрерывно по всей длине, а другая должна образовываться дискретно, присоедине нием репликационных фрагментов. Однако у некоторых организмов обе цепи могут синтезироваться дискретно. [c.199]

Исследователей репликации вирусов М13 и ФХ ожидал еще один сюрприз. Оказалось, что для образования RF-ДНК необходима РНК-полимераза. Это послужило одним из многих доводов в пользу предположения, согласно которому для того, чтобы начать синтез ДНК необходим небольшой фрагмент (затравка) РНК [уравнение (15-3)]. Аналогичные наблюдения были сделаны при изучении репликации ДНК плазмиды колицин Е-1. Этот процесс чувствителен ik рифампицину — специфичеокому ингибитору РНК-полимеразы (дополнение 15-А). Для репликации ДНК наряду с дезоксирибонуклеозидтрифосфатами необходимы также четыре рибонуклеозидтрифосфата [203]. [c.277]

В ходе Р. рост цеш1 осуществляется благодаря взаимод. дезоксирибонуклеозидтрифосфата с З -ОН концевым нуклеотидом уже построенной части ДНК при этом отщепляется ш1рофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи (рис. 2) идет только с ее З -конца, т. е. в направлении 5 3 (см. Нуклеиновые кислоты). Фермент, катализирующий эту р-цшо,-ДНК-полиме-раза (см. Полидезоксирибонуклеотид-синтетазы)-пе способен начать матричный синтез на одноцепочечной ДНК, если нет хотя бы олигонуклеотидного биспирального участка (т. наз, затравочного ол ггонуклеотида) комплементарного матрице затравочным олигонуклеотидом во мн. случаях является не ДНК, а РНК. [c.252]

Фермент ката-тизирует нуклеофильную атаку З -гидроксильной группы затравки, направленную наа-фосфат очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата (в том случае, если ои комплементарен матрице матрица иа рисунке не показана) [c.46]

Рибонуклеозидтрифосфаты и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не являются субстратами фермента. Фермент не нуждается в матрице, однако для синтеза необходима затравочная цепь РНК (НМФ) со свободной З -гидроксильной группой, к которой присоединяются остатки мононуклеотидов. Образовавшаяся полимерная молекула РНК не имеет заданной специфггческой последовательности мононуклеотидов, но содержит 3 —>5 фосфодиэфирные связи, легко разрываемые рибонуклеазой. Относительно биолопгческой роли этого фермента у бактерий предполагают, что он катализирует, скорее всего, обратную реакцию —расщепление мРНК с образованием нуклеозиддифосфатов. [c.495]

Таким образом, под названием ПЦР понимают основной хщкл денатурации, отжига и синтеза фрагментов ДНК в присутствии ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и праймеров Процесс по существу является цепным, так как продукты данной реакции служат матрицей для последующих реакций На первых этапах использовали в ПЦР так называемые "кле-новские фрагменты ДНК-полимеразы I Е ob (названы по фамилии ученого — X Кленова), которые оказалисьтермолабилъными, и после каждого цикла денатурации необходимо было добавлять новую порцию фермента Кроме того, гфи пониженной температуре отжига снижалась специфичность амплификации [c.205]

Дезоксирибонуклеотиды. В организме дезоксирибонуклео-тиды находятся главным образом в составе молекулы ДНК. В небольшом количестве иногда они могут быть обнаружены преимущественно виде дезоксирибонуклеозидтрифосфатов как предшественники в синтезе ДНК. [c.8]

ДНК расщепляется до нуклеотидов под действием дезоксирибонуклеазы, которая является высокоспецифичным ферментом, иа РНК и рибополинуклеотиды она не действует. Растительная дезоксирибонуклеаза обладает особенно высокой активностью в период прорастания семян. ДНК может расщепляться до дезоксирибонуклеозидтрифосфатов также под действием ДНК-нуклеотидилтрансферазы. [c.281]

Полимеризация дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в поли-дезоксирибонуклеотид в присутствии соответствующей затравки ДНК (фиг. 60). [c.182]

З -гидроксилконцевые группы в большей степени становятся доступными для нуклеофильной атаки а-фосфатной группы дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. В таком случае следует думать, что деградированная ДНК работает не как матрица, а ее свободные концы используются для насаживания на них новых нуклеотидов (стр. 210). Искусственно синтезированные тимидиновые полимеры, содержащие от трех до семи тимидиловых остатков, также оказались в этом отношении весьма эффективными [42]. [c.202]

И диэстеразой из селезенки (стр. 92) до дезоксирибонуклеозид-3 -монофосфатов. В результате такого гидролиза остается вязанным с С-3 -дезоксирибозы того нуклеотида (в нашем случае Z на фиг. 68), с которым реагировал меченый трифосфат. Z может быть любым из четырех оснований. Все нуклеотиды разделяют с помощью электрофореза на бумаге. Затем измеряют их радиоактивность и тем самым получают данные по относительной частоте, с которой нуклеотид, первоначально меченный в положении 5, располагается возле другого нуклеотида в новой цепи. Эту процедуру повторяют четыре раза, причем каждый раз берут другой меченый дезоксирибонуклеозидтрифосфат. Полученные результаты позволяют представить себе, какие сочетания двух оседних нуклеотидов (динуклеотидов) встречаются чаще всего из всех шестнадцати возможных сочетаний [45]. Данные такого опыта, проведенного с Д]ТК из My oba terium phlei, приведены в табл. 17. [c.205]

Экстракты из тканей животных содержат фермент, осуществляющий добавление нуклеотидильных звеньев к концам полинуклеотидных цепей. Обычная ДНК-полимераза требует присутствия всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ионов магния и ДНК-затравки, представляющей собой одноцепочечный полинуклеотид, на котором собирается новая, комплементарная цепь. Поэтому фермент можно назвать репдикациопным ферментом его активность подавляется при отсутствии одного или нескольких трифосфатов. Второй фермент, описанный в 1962 г. [46], катализирует включение концевых нуклеотидных звеньев в молекулу ДНК-затравки за счет отдельных трифосфатов. Он не стимулируется добавлением остальных трех трифосфатов, но цистеин усиливает его активность. Его можно назвать концевым или терминальным ферментом [47, 48] его можно использовать при биосинтезе полидезоксиадениловой кислоты [491. [c.211]

Если инкубировать ДНК-полимеразу в присутствии дАТФ, дТТФ и ионов магния, но без ДНК-затравки, то образуется интересный полимер, содержащий аденин- и тиминнуклеотиды [18, 50]. Полимер начинает синтезироваться только после лаг-периода в несколько часов затем процесс протекает с большой скоростью. Синтез закапчивается лишь после того, как будет использовано 60—80% трифосфатов. Если такой полимер выделить и затем внести его как затравку в среду в присутствии ДНК-полимеразы и двух из четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, то будет наблюдаться очень быстрый и интенсивный синтез идентичного полимера. [c.212]

Синтез ДНК (Корнберг) происходит при наличии в системе ДНК — полимеразы, всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ и ТТФ) и минимального количества ДНК- затранки . При этом освобождается пирофосфат. Синтезируемая ДНК точно соответствует ДНК затравке . ДНК затравка функционирует как матрица для своей собственной репликации путем разделения двух нитей и образования вокруг каждой из них новой нити с комплементарным (стр. 60) расположением оснований. [c.379]

Для реакции необходимо присутствие ионов двухвалентного металла, обычно магния. При замене ионов магния ионами марганца специфичность реакции существенно изменяется в присутствии субстратами могут служить только дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в присутствии же Мп в реакцию вступают также рибонуклеозидтрифосфаты. Таким образом, в системе, содержащей Мп , могут синтезироваться смешанные рибо-и дезоксирибонуклеиновые кислоты. [c.509]

ДНК-зависимая ДНК-полимераза (К. Ф. 2. 7. 7. 7.) — ДНК-нуклеотидилтранс-фераза, или фермент Корнберга (ДНК-полимераза 1), осуществляющий полимеризацию дезоксирибонуклеозидтрифосфатов на ДНК-матрице в присутствий ионов Выделенный из кишечной палочки после тщательной очистки фермент представляет собой препарат, гомогенный по критериям седиментации, хроматографии и электрофореза в крахмальном геле. Наряду с полимеразной активностью фермент обладает также экзонуклеазной активностью. [c.50]

ДНК-полимераза II — ассоциированный с клеточной мембраной кишечной палочки фермент, синтезирующий из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов ДНК в направлении 5 - 3. Он максимально активен при наличии всех четырех трифосфатов, [c.52]

Субстратами для данной реакции служат дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. В ходе реакции от каждого из них отщепляется дифосфатный остаток. Использование в качестве субстратов в данной реакции дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов делает процесс образования фосфодиэфир-ных связей в молекуле ДНК термодинамически выгодным. [c.349]

Для осуществления синтеза в системе должны присутствовать все четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (для ДНК-полимеразы) или рибонуклеозидтрифосфата (для РНК-поли-меразы) в отсутствие хотя бы одного из них синтез протекать не будет. [c.11]

Другим способом введения метки в ДНК in vitro, который находит все более широкое применение, является ник-трансляция [15, 37, 48, 50]. В этом случае сначала ДНК инкубируют с панкреатической ДНКазой I, под действием которой в ДНК образуются одноцепочечные разрывы. Затем ДНКазу инактивируют, а ДНК инкубируют с полимеразой I Е. oli и натриевыми солями четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (один из которых является радиоактивным, обычно с меткой Н). [c.135]

Другой, энзиматический, метод был разработан Ф. Сэн-гером в Великобритании. Исследуемый фрагмент ДНК при клонировании встраивается рядом с определенной последовательностью, к которой имеется комплементарная затравка. Используя такую затравку, ведут синтез ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы в присутствии меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Иногда вместо меченых предшественников используют меченую затравку. В результате происходит считывание исследуемого фрагмента. В реакционную смесь, разделенную на четыре порции, добавляют по одному из четырех дидезоксири-бонуклеозидтрифосфатов в каждую. Последние способны включаться в растущую ДНК, вставая на правильное место, но затем останавливают дальнейший рост ДНК, терминируют ее синтез. Опять-таки проводят разделение смеси образовавшихся цепей ДНК электрофорезом и затем авторадиографию. По четырем дорожкам читают нуклеотидную последовательность ДНК. [c.32]

Ник-трансляция — процедура довольно длительная, и начинать ее следует как можно раньше. Обязательно наденьте фартук для работы с радиоактивностью, халат, заи итные очки и двойные перчатки. Пользуясь ручным счетчиком, постоянно проверяйте, нет ли загрязнения радиоактивностью (см. методику 22). Необходимо заранее запастись ф-СТР или другим меченным з Р дезоксирибонуклеозидтрифосфатом, ДНКазой I, дезо-ксирибонуклеозидтрифосфатами, а также буфером 10XNT, останавливающим раствором и буфером ТЕ. [c.49]

Смотреть страницы где упоминается термин Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты: [c.431] [c.277] [c.46] [c.150] [c.479] [c.162] [c.205] [c.476] [c.204] [c.204] [c.223] [c.50] [c.301] [c.346] [c.346] [c.58] [c.125] [c.282] [c.287] [c.288] [c.290] [c.73] [c.79] [c.79]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология