Химотрипсин с диизопропилфторфосфатом

Благодаря сочетанию рентгеноструктурных и химических исследований бьша выяснена детальная топография активного центра химотрипсина, состоящего из трех полипептидных цепей, соединенных друг с другом дисульфидными связями остатков цистина (дополнение 9-4, Б). Химические исследования показали, что при инактивации химотрипсина диизопропилфторфосфатом образуется ковалентное производное остатка серина в положении 195 полипептидной цепи отсюда следует, что этот остаток входит в состав активного центра. По данным других химических исследований, остаток гистидина в положении 57 и остаток аспарагиновой кислоты в положении 102 также участвуют в каталитическом процессе. Хотя эти остатки занимают в полипеп-тидном остове положения, находящиеся далеко друг от друга, и даже в разных полипептидных цепях, данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют [c.256]

Если на химотрипсин воздействовали диизопропилфторфосфатом, меченным то P оказывался прочно связанным с ферментом ковалентной связью. Дальнейшие эксперименты показали, что при денатурации меченого фермента и последующем его гидролизе кислотой высвобождения Р не происходит. Образующийся радиоактивный фрагмент был [c.107]

Что представляет собой группа —в этом уравнении Опыты с диизопропилфторфосфатом указывают на то, что —0 -группа принадлежит ег-195. Однако этому предположению противоречит очень слабая кислотность —СНгОН-группы. Кроме того, согласно другим данным, роль группы —В выполняет имидазольная группа гистидина. Например, известно, что каталитическая активность химотрипсина при гидролизе сложных эфиров меняется с изменением pH. В то время как кон- [c.108]

Показано, что каждая молекула химотрипсина реагирует с одной молекулой диизопропилфторфосфата (IX), причем образуется фермент, полностью утративший активность. Полный гидролиз фермента указывает на то, что фосфор связан с серином (X) это было интерпретировано как свидетельство в пользу того, что серии является непосредственной составной частью активного участка фермента. [c.130]

Принцип торможения ферментного действия находит применение для поиска новых лекарственных препаратов. Исследование действия ингибиторов на ферменты привело к установлению природы активного центра некоторых ферментов. Например, применение диизопропилфторфосфата позволило установить наличие ОН-группы серина в активном центре химотрипсина. [c.302]

Ацильная группа, входящая в состав интермедиата ацил-ХТ, связана с высокореакционноспособным остатком серина Ser 195. Особая роль и высокая реакционная способность Ser 195 проявляется в способности этого остатка (отсутствующей у остальных 27 сериновых остатков химотрипсина) вступать в реакцию с диизопропилфторфосфатом (ДИФФ) (рис. 9.4). Аналогичные реакции характерны и для других сериновых протеаз. [c.92]

При обработке а-химотрипсина диизопропилфторфосфатом происходит полная потеря ферментативной активности (см. стр. 208). При этом одновременно и в равной степени подавляется как протеиназная, так и эстеразная активность фермента. [c.210]

ПРОНАЗА, смесь частично очищенных протеолитич ферментов из микробов 31гер1отусе5 gri.seus, содержащая нейтр. и щел. протеиназы (см. Протеолитгтеские ферменты), а также протеиназы, близкие по характеру действия химотрипсину и карбоксипептидазам. Мол. м. компонентов 16 000—20 ООО. Обладает широкой субстратно специфичностью, при pH 7—8 гидролизует в казеине и альбумине 80—85% пептидных связей. Активность разл. комнонентов П. подавляется хелатами, диизопропилфторфосфатом, хлоркетонами. Активизируется Са +, Со +, Мп +, Примен. при исследовании строения белков ПРОПАЗИН. триазин [c.480]

В 1949 г. было показано, что один из ядов нервно-паралитического действия, диизопропилфторфосфат (ДФФ), инактирует химотрипсин. [c.107]

Неожиданным явился разрыв связи —ЦиЗОзН.Сер— под действием химотрипсина. В контрольных опытах с химотрипсином, который предварительно инкубировался со специфическим ингибитором — диизопропилфторфосфатом, разрыва [c.203]

Этот фермент может быть выделен из экстрактов поджелудочной железы в чистом виде [128], но до использования для определения последовательности аминокислот его рекомендуется инкубировать с диизопропилфторфосфатом, чтабы инактивировать возможные примеси химотрипсина, трипсина и субтилизина [122, 267, 300]. Основные свойства и специфич-кость действия карбоксипептидазы подробно рассмотрены в ряде работ [228 293]. В Других работах [114, 136, 226, 320] приводятся данные об использовании фермента для определения последовательности аминокислот в белках. Карбоксн-Пептйдаза специфична в отношении С-концевых аминокислот [c.232]

Функциональные группы активного центра химотрипсина идентифицированы с помощью необратимых ингибиторов. Остаток Ser-195 был модифицирован диизопропилфторфосфатом и фенил-метилсульфофторидом, а остаток His-57 — К-тозил-Ь-фенилала-ннл-хлорметилкетоном <см, рнс. 89 и с- 171). Двухстадинность процесса химотрипсинового гидролиза была обнаружена при изучении кинетики гидролиза п-нитрофенилацетата. [c.197]

ХИМОТРИПСИН, фермент класса гидролаз, относится к эндопептидазам. Мол. масса бычьего X. 25 300, р1 9, оптим. каталитич. активность при pH 7,5—8,0, состоит из трех цепей, связанных дисульфидными мостиками. По типу каталитяч. центра относится к группе серин-гистидиновых гидролаз. Образуется в поджелудочной железе позвоночных из предшественника (химотрипсиногена) последоват. отщеплением двух дипептидов в середине цепи. Катализирует гидролиз белков, пептидов, эфиров и амидов аминокислот проявляет специфичность к гидрофобным аминокислотам, участвует в расщеплении белков пищи в тонком кишечнике. Ингибируется ионами тяжелых металлов, борорг. к-тами, диизопропилфторфосфатом и др. Избирательно гидролизует белки пораженных тканей. Использ. для лечения тромбозов, ожогов. [c.654]

Ионы металлов. Ферменты, можно разделить на три класса ления активности которых необходимы иптактные тиольные группы (папаин, фицин и подобные им ферменты растительного происхождения некоторые катепсины). 2. Ферменты, которые ингибируются диизопропилфторфосфатом и подобными фосфор-органическпми соединениями (сериповые эстеразы, например трипсин, химотрипсин, субтилизин, холинэстераза, тромбин и т. д.). 3. Ферменты, для проявления активности которых необходима добавка иона металла или наличие прочно связанного иона металла. К ферментам класса (3) относится ряд дипептидаз, которые не удалось получить в чистом виде глицилглицин-дипептидаза [активирующее действие ионов металлов уменьщается в следующем ряду Со(П) >Л п (II) >М (11) =0>7п П), причем последний ион выступает уже в роли ингибитора] [183], глицил-ь-дипептидаза [2п( П)—фермент из мышц крысы. [c.124]

Получение карбоксипептидазы из поджелудочной железы является относительно длительной процедурой. Детальная. методика очистки, основывающаяся на оригинальном методе Айсона [1] описана Нейратом [2]. При использовании продажных препаратов, фермента их обычно обрабатывают диизопропилфторфосфато.м (ДФФ) для подавления активности следовых количеств химотрипсина, трипсина и субтилизина. [c.187]

Прочие протеиназы, обладающие эстеразным действием, при ингибировании их диизопропилфторфосфатом точно так же образуют кристаллические соединения [142]. При данной концентрации ДФФ протеиназная и зстеразная активности а-химотрипсина, j -химотрипсина, у-химотрипсина и трипсина в каждом случае ингибируются почти в одинаковой степени. В каждое из этих производных вводится приблизительно 1 моль фосфора, [c.324]

Из гидролизата неактивного соединения, образовавшегося при взаимодействии а-химотрипсина с диизопропилфторфосфатом, был выделен 0-фосфорилсерин Таким образом было показано, что гидроксил серина является тем центром, блокирование которого диизопропилфторфосфатом вызывает потерю ферментативной активности а-химотрипсина. [c.211]

Гидроксильная группа серина, принимающая участие в этих реакциях, должна обладать повышенной реакционной способностью, поскольку из двадцати шести остатков серина, содерн ащихся в а-химотрипсине, только один реагирует с диизопропилфторфосфатом или ацилируется. Свободный серин вообще не реагирует с диизопропилфторфосфатом. Предшественники ферментов (трипсиноген и химотрипсиноген), а также денатурированные а-химотрипсин и трипсин не взаимодействуют с диизопропилфторфосфатом. [c.211]

Ряд экспериментальных данных приводит к заключению, что группой, активирующей гидроксильную группу серина, является имидазольная группа гистидина. Участие имидазольной группы гистидина в ферментативном процессе было доказано избирательным фотоокислением одного из двух остатков гистидина а-химотрипсина в присутствии метиленового синего. Скорость фотоокисления гистидина и скорость инактивации фермента были приблизительно одинаковы, и потеря 50% ферментативной активности совпадала по времени с разрушением 0,48 моль гистидина на 1 молъ а-химотрипсина. Фотоокисление фермента, а также взаимодействие одного из гистидиновых остатков с динитрофторбензолом приводит к потере способности а-химотрипсина реагировать с диизопропилфторфосфатом. [c.212]

Волнение, вызванное выявлением того факта, что белки, связывающие кислород,— гемоглобин и миоглобин — имеют одинаковую третичную структуру и выполняют одинаковые функции, вновь овладело учеными, когда было установлено, что аналогичная ситуация имеет место в случае сериновых протеаз млекопитающих. Эти ферменты названы так потому, что они имеют уникальный по своей активности сериновый остаток, который необратимо реагирует с фосфорорганическими соединениями, например с диизопропилфторфосфатом. Основные панкреатические ферменты — трипсин, химотрипсин и эластаза — кинетически весьма близки и гидролизуют пептиды и синтетические сложные эфиры. Их активность имеет оптимум при рН= 7,8 и определяется состоянием ионизации групп с р/(а = = 6,8. Во всех трех случаях в процессе реакции образуется ацилфермент , в котором карбоксильный фрагмент субстрата образует сложноэфирную связь с гидроксильной группой активного серина. [c.27]

Эти эксперименты показывают, что промежуточным соединением в реакции гидролиза эфиров является ацилфермент, который можно выделить при низких pH. Константа скорости де-ацилирования ацилфермента имеет такое же значение, какое было получено из данных по стационарной кинетике. Из опытов по изучению реакции ацилирования следует, что промежуточное соединение образуется довольно быстро, в стехиометрическом соотношении 1 1. Естественно, что ни в одном из этих экспериментов не было показано, что ацилируется именно Ser-195. Окончательно этот вопрос был решен лишь при рентгеноструктурном анализе индолилакрилоил-химотрипсина (гл. 1) [15]. Вывод об участии в ацилировании Ser-195 был подтвержден классическим путем, состоящим в необратимом ингибировании фермента эфирами фосфорной кислоты (например, диизопропилфторфосфатом) с последующим выделением фосфатсодержащего пептида после частичного гидролиза белка [16, 17]. [c.218]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология