Ферментативный гидролиз пептидов

Ферментативный гидролиз — расщепление белка протеолитическими ферментами, который обычно проводится при 37°. Ферментативным гидролизом обычно пользуются для получения пептидов — продуктов неполного гидролиза белков. [c.203]

Единственная химическая реакция, которая здесь будет рассматриваться, —это гидролиз. Он может осуществляться как ферментативным, так и химическим путем. Горячая разбавленная минеральная кислота медленно расщепляет амидные связи с образованием с учайных фрагментов, в конечном итоге приводя к простым аминокислотам. Контролируемый кислотный гидролиз разрушает белок с образованием смеси пептидов. Возможен также ферментативный гидролиз протеолитические ферменты очень разнообразны по своему специфическому действию. Некоторые из них, такие, как папаин или фицин, фактически неспецифичны и расщепляют белки до свободных аминокислот, в то время как другие — трипсин, химотрипсин и пепсин— гидролизуют только особые связи в белковых молекулах (ср. мальтаза, эмульсин и т. д., разд. 17.6 и 17.7). Так, пепсин расщепляет амидную связь между карбоксильной группой ди-карбоновой ь-аминокислоты и аминогруппой ароматической ь-аминокислоты при условии, что вторая карбоксильная кислотная группа дикарбоновой аминокислоты не связана. Химотрипсин менее специфичен и расщепляет амидную связь с карбонильной стороны ароматической ь-аминокислоты. Трипсин гидролизует амидные связи, включающие карбоксильные груп- [c.296]

Полипептидные цепи при ферментативном гидролизе расщепляются на большое число сравнительно мелких пептидов, что затрудняет их разделение и идентификацию. Поэтому за последнее время все более широкое распространение приобретают методы химического расщепления пептидных связей, образованных аминокислотами, редко встречающимися в белках. Это позволяет получать ограниченное число крупных пептидов. [c.141]

Ферментативный гидролиз проходит в мягких условиях и не сопровождается вторичным распадом аминокислот. К числу недостатков этого метода можно отнести возможный вторичный синтез пептидов. [c.516]

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

Белок, содержащий цистин и, следовательно, имеющий дисуль-фидные связи, подвергают ферментативному гидролизу. Следует подобрать такой фермент, который обеспечит получение мелких пептидов, т. е. расщепит цепь во многих точках. Наименее пригоден для этой цели трипсин из-за высокой избирательности действия, а также из-за хорошо известной устойчивости белков, содержащих дисульфидные связи, к триптическому гидролизу. [c.106]

Основная проблема, однако, состоит в том, что белковая молекула, состоящая из идентичных субъединиц, будет давать пептидную карту с гораздо меньшим числом фрагментов, чем предсказывает теория на основе только молекулярного веса. С другой стороны, изозим, состоящий из разных полипептидных цепей, может дать пептидную карту с большим числом пептидов, чем ожидается для идентичных полипептидных цепей и с меньшим числом пептидов, чем можно ожидать на основе молекулярного веса всей белковой молекулы, потому что некоторые части разных полипептидных цепей имеют идентичную первичную структуру. Ферментативный гидролиз можно заменить неферментативным расщеплением пептидных связей, например при реакции белка с бромцианом. В этом случае расщепление полипептидных цепей происходит специфически по остаткам метионина [78]. [c.402]

Хорошие результаты удается также получить при использовании масс-спектрометрии с ионизацией полевой десорбцией или бомбардировкой ускоренными атомами для анализа С-концевой последовательности пептидов в сочетании с ферментативным гидролизом с помощью карбоксипептидаз. [c.74]

Однако, исходя из этих элементов, трудно предсказать полную последовательность глиадинов. Анализ пептидов, получаемых в результате ферментативного гидролиза очищенных глиадинов, показывает, что они значительно различаются по своим размерам и составу [43], несмотря на очевидное сходство разных глиадинов. [c.193]

После ферментативного синтеза пептидов из Ы-защищенных аминокислот и анилидов аминокислот трудно гидролизовать а и-лидную группу без одновременного расщепления пептидных связей. Это затруднение удалось преодолеть путем применения Ы -фенил-гидразидов вместо анилидов. Защитную группу в образовавшихся пептидах можно удалить окислением солями меди(П) [1221 или хлорным железом [425]. [c.248]

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием кислотного (НС1), щелочного [Ba(OH)J и, реже, ферментативного гидролиза или одним из них. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащего примесей, освобождаются 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии либо в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами. [c.33]

При специфическом ферментативном гидролизе или химическом расщеплении любого белка среднего молекулярного веса получается довольно сложная смесь пептидов. Выделение и очистка всех пептидов, из которых состояла полипептидная цепь и которые содержатся в нефракционированном гидролизате, — задача достаточно трудная. Поэтому гидролизат белка рекомендуется сначала подвергнуть предварительному разделению. Среди современных методов фракционирования наиболее подходящим для этой цели является гель-фильтрация. [c.226]

Гидролиз белков с помощью ферментов имеет как преимущества, так и недостатки по сравнению с кислотным гидролизом. Обычно ферментативный гидролиз не сопровождается деструкцией. При правильном выборе ферментов можно получить большой набор пептидов различной величины. Имея перекрывающиеся пептиды, значительно легче устанавливать последовательность аминокислот. Таким образом были выделены некоторые пептиды, которые невозможно получить при кислотном гидролизе. [c.394]

Ферментативный гидролиз белков. Организм животного ассимилирует только свободные аминокислоты, но не белки или пептиды. При пищеварении происходит полный гидролиз белков до аминокислот. [c.425]

Определение иммобилизованных белков, пептидов, аминокислот, нуклеотидов, углеводов и других веществ после их освобождения с помощью кислотного, щелочного или ферментативного гидролиза [c.247]

Данные, приведенные выше, позволяют установить последовательность четырех частей цепи А, но остается неясным, какой из двух центральных фрагментов, Ser-Val- ys или Ser-Leu-Tyr, стоит первым. Этот вопрос был решен ферментативным гидролизом цепи А действием пепсина, что приЕело к пептиду, не содержавшему аспарагиновой кислоты (Asp) или тирозина (Туг). Гидролиз этого пептида дал Ser-Val- ys и Ser-Leu. [c.1068]

Работы Бергмана и его сотрудников показали, что для ферментативного гидролиза пептидов необходимо наличие боковых цепей определенной структуры. Так, например, для протеолитического действия трипсина необходимо наличие в пептидах щелочных боковых цепей, пепсин же проявляет свое действие при наличии боковых цепей, содержащих ароматические или кислые аминокислоты. Ниже на примере тетрапептида тирозил-лизилглутамилтирозииа показаны отдельные группы, необходимые для действия различных ферментов [13]. [c.364]

Реже используются другие варианты ферментативного гидролиза хпмотринсином, протеазой из Staphylo o us aureus (по Asp и Glu), термолизином (по Val, Leu, Пе и Phe). Главные их недостатки — множественность п неравноценность точек разрыва. При гидролизе исходного белка это дает высокий фон, однако для дополнительного гидролиза уже очищенных пептидов указанные методы вполне пригодны. [c.298]

В 1977 г. было опубликовано подробное онисапие такого фрак-щюпирования [Сгасу, 1977]. Прежде всего проводили подготовку и ферментативный гидролиз белка. Подготовка состояла в карбокси-ыетилированпи остатков цистеина во избежание образования побочных S—S-связей между пептидами в результате их окисления в ходе эксперимента. [c.486]

Образование регулярных полипептидов имеет место также при пластеиновой реакции (521, 522], при которой под каталитическим воздействием различных протеаз (трипсин, хнмотрипсии, пепсин, катепсин и т. д.) из так называемых пластеинак-тивных пептидных мономеров получаются продукты конденсации — пластеины. В качестве субстратов годятся продукты частичного ферментативного гидролиза белков (пептоны, альбумозы и др.). Первый пластеиноактивный синтетический пептид имел последовательность Туг-Пе-01у-01и-РЬе. [c.211]

Расщепление полипептидных цепей, содержащих дисульфидные мостики, обычно приводит к сложной смеси низших пептидов. При реконструкции полипептидной цепи установление исходного порядка дисульфидных связей — довольно трудная задача. Один из путей ее решения дает диагональный электрофорез по Хартли, при котором пептиды после ферментативного гидролиза сначала разделяют электрофоретически на полосе бумаги. [c.365]

Один нз методов идентификации Л -концевой аминокислоты пептида нли белка состоит в замещении -аминогруппы иа такую груп-. пу, которая выдерживает гидролиз, и таким образом, после кислотного нлн ферментативного гидролиза меченую аминокислоту можно обнаружить спектрофотометрнчески, спектрофлуорометри-чески илн по радиоактивности и идентифицировать с помощью хроматографии. [c.264]

Из методов неспецифического ферментативного расщепления чаще всего применяется гидролиз пепсином, папаином, бактериальными или грибковыми протеазами. Все три типа ферментов дают гидролизаты, представляющие собой сложную смесь мелких пептидов. В связи с этим их лучше использовать на конечных этапах расщепления крупных пептидов, полученных методами специфического гидролиза. Общий обзор методов ферментативного гидролиза сделал Хилл [34] подробные сводки о действии пепсина, папаина и бактериальных протеаз опубликовали Бовей и Янари [2], Смит и Киммель [781 и Хагихара [28] соответственно. [c.35]

SH-группы остатков цистеина и существующие исходно или возникающие в ходе реакции дисульфидные связи могут стать источником артефактов при полном или частичном гидролизе исследуемых белков и пептидов. Дисульфидные мостики, возникающие в результате окисления SH-rpynn, могут а) неспецифически расщепиться в ходе гидролиза или б) при ферментативном гидролизе обусловливать обрг зование фрагментов сложной структуры. [c.165]

Ферментативный гидролиз можно проводить различными способами, один из которых состоит в следующем в пластмассовой пластинке толщиной 10—15 мм, длиной 10 см и шириной 5 см высверливается 2 ряда углублений. Объем всех, кроме одного, углублений должен быть примерно 50 мкл, а объем крайнего верхнего — в 3 раза больше. Это углубление выполняет роль реакционного сосуда обозначим его через Р, а все остальные цифрами 1, 2, 3...п. Исследуемый пептид (около 0,05 мкмоль) в 0,1 М бикарбонате аммония вносят пипеткой в углубление Р. Во все остальные углубления наливают по 10 мкл 1 н. НС1. После этого в углубление Р добавляют соответствующий фермент (например, карбоксипептидазу А, кар-боксипептидазу В или их смесь, а в случае N-концевого анализа — амино пептидазу). Количество фермента составляет часть количества пептида. Сразу после добавления фермента 10 мкл смеси из реакционного сосуда переносят в углубление 1, где уже находится НС1. [c.257]

Осуществленный таким способом гидролиз пептидньк связей-это необходимый шаг в определении аминокислотного состава белков и последовательности составляющих их аминокислотных остатков. Пептидные связи могут быть гидро-лизованы также под действием некоторых ферментов, таких, как трипсин и химотрипсин, представляющие собой протеолитические (белок-расщепляю-щие) ферменты, секретируемые в кишечник и способствующие перевариванию, т. е. гидролитическому расщеплению, белков, входящих в состав пищи. Если кипячение пептидов с кислотой или щелочью приводит к гидролизу всех пептидных связей независимо от природы и последовательности соединенных при их помощи аминокислотных звеньев, то трипсин и химотрипсин осуществляют каталитическое расщепление пептидов избирательным образом. Трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которьсс участвуют карбоксильные группы лизина или аргинина. Химотрипсин же атакует только те пептидные связи, которые были образованы с участием карбоксильных групп фенилаланина, триптофана и тирозина. Как мы увидим дальше, такой избирательный ферментативный гидролиз оказьшается очень полезным при анализе аминокислотных последовательностей белков и пептидов. [c.130]

Пролин в середине цепи, дает при восстановлении новый пептид с N-концевым пролином, из которого пролин можно выделить ферментативным гидролизом L-пролиниминопептндазой. [c.150]

При ионизации полевой десорбцией масс-спектры пептидов состоят практически из одних молекулярных ионов. На этой основе Я. Шимониши был разработан метод исследования структуры белка путем непосредственного анализа смеси пептидов, получаемых после ферментативного гидролиза. Смесь пептидов подвергается деградации по методу Эдмана, и после каждого этапа, наряду с идентификацией отщепленных аминокислот, масс-спектрометрически по молекулярным ионам определяются молекулярные массы [c.73]

Последовательность операций на этой стадии следующая вначале проводится ферментативный гидролиз нативного белка в условиях, исключающих дисульфидный обмен (т. е. при pH ниже 7,0), полученная смесь пептидов фракционируется и у выделенных ци-стинсодержащих фрагментов после восстановления дисульфидной саязи определяется аминокислотная последовательность. Разделе- [c.75]

При расшифровке последовательности остатков аминокислот в Б частично гидролизуют полипептидную цепь, разделяют получающиеся фрагменты, определяют их аминокислотный состав и выясняют т. наз. N- и С-концевыми методами чередование в них аминокислотных остатков Применяя различные способы частичного гидролиза, устанавливают строение большого числа различных пептидных фрагментов, затем находят тождественные (перекрывающиеся) участки этих пептидов, по этим данным устанавливают последовательность расположения остатков в исходной цепи. Если молекула Б. состоит из нескольких полипептидных цепей, то их предварительно разделяют. Полипептидную цепь, состоящую из большого числа (ботее 150—200) остатков, предварительно подвергают Селективному гидролизу на несколько частей (напр., обработкой бромцианом, обычно разрывающим пептидные связи около немногочисленных остатков метионина). Локализацию дисуль-фидных связей устанавливают частичным (обычно ферментативным) гидролизом, выделением пептидов с дисульфидными связями и разрывом этих связей окислением (напр, надмуравьиной к-той), каждую образующуюся пару пептидов с сульфогруппами цистеиновой к-ты разделяют, устанавливают строение пептидов и находят их места в уже расшифрованной полипептидной цепи. [c.121]

Для расщепления полипептидной цепи на отдельные фрагменты можно использовать несколько методов. Один из широко распространенных методов-это частичный ферментативный гидролиз полипептида под воздействием пищеварительного фермента шрнисмка. Каталитическое действие этого фермента отличается высокой специфичностью гидролизу подвергаются только те пептидные связи, в образовании которых участвовала карбоксильная группа остатка лизина или аргинина независимо от длины и аминокислотной последовательности полипептидной цепи (табл. 6-6). Число более мелких пептидов, образующихся под действием трипсина, можно, следовательно, предсказать, исходя из общего числа остатков лизина и аргинина в исходном полипептиде. Полипептид, в котором содержатся пять остатков лизйна и (или) аргинина, при расщеплении трипсином обычно дает шесть более мелких [c.148]

Если бы не было ферментов желудочного сока, организм не смог бы переварить потребляемую пищу. Учащиеся должны знать, что полный гидролиз белков пищи до аминокислот не может быть осуществлен только одним ферментом, для этого необходимо совместное действие нескольких ферментов желудочного сока — пепсина, трипсина, химотрипсина, гидролизующих природные белки пищи до больших пептидов и затем пептидазов, гидролизующих пептиды до аминокислот. Преподаватель дает определение ферментативному гидролизу белка — процесс превращения белков пищи в аминокислоты, протекающий в желудке. [c.148]

Приготовление пробы. Пептиды триптического гидролиза гемоглобина могут быть получены по методу Джонса [100]. Лио-филизованную смесь пептидов растворяют в 0,3 М пиридине и доводят pH раствора до 2,2 с помощью концентрированной соляной кислоты. Другие методы ферментативного гидролиза описаны Смитом [36] и Блакбурном [34]. [c.78]