Клонирование антител J С также

Чтобы снизить вероятность получения ошибочных результатов, мы советуем исследовать лизат, содержащий гибридные белки, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антител к -галактозидазе (рис. 5.3) —это позволяет детектировать все минорные продукты. Кроме того, все получаемые результаты необходимо сопоставить с анализом нуклеотидной последовательности клонированный ДНК. Для идентификации продуктов клонированных генов можно также использовать вторые антитела, специфичные к антигенным детерминантам, которыми предположительно должен обладать гибридный белок. Поскольку уровень экспрессии гибридных белков высок, мы рекомендуем использовать иммуноферментный метод выявления антигенов с помощью вестерн-блот-анализа (табл. 5.2) ввиду надежности и быстроты этого метода. [c.149]

Последние достижения в развитии новейших технологических приемов значительно расширили наши возможности в определении генетического строения и молекулярной структуры вирусов, а также выявлении сходства штаммов и идентификации различий между вариантами вирусов. Наиболее важные из этих методов — клонирование и определение последовательности нуклеиновых кислот, картирование РНК и пептидов, а также антигенный анализ белков с помощью моноклональных антител. Задача последней обзорной главы данной книги — обсуждение эпидемиологии вируса гриппа в свете применения этих новых методов. Особое внимание уделено оценке последних достижений и изучению вопросов эпидемиологии, которые могут быть успешно решены при использовании молекулярных методов. [c.313]

Чем эффективнее гибридизация, тем больше вероятность, что в каждой лунке вырастет более одного клона и что два клона со сходными темпами роста будут сосуществовать в одной лунке. Наличие двух и более клонов можно выявить по обнаружению в супернатанте антител более чем одной специфичности и более чем одного класса и подкласса, а также с помощью изоэлектрофокусирования (сложный спектр анализируемых антител). При получении соответствующего результата необходимо безотлагательное клонирование. [c.138]

На первый взгляд кажется, что описанная выше процедура требует много времени. Результат оказывается наиболее хорошим, если проверяют одно или два разведения супернатанта из каждой лунки и, таким образом, оценивают титр антител. Соответственно в процессе клонирования могут быть отобраны клетки, продуцирующие возрастающее количество антител. В нашей лаборатории с целью отбора проб для приготовления разведений в нестерильных панелях для микротитрования, а также последующего переноса проб в панели для проведения РИА мы используем многоканальную пипетку. Благодаря этому исследование 48 проб из каждой панели занимает совсем немного времени. Имея соответствующие навыки, процедуру лимитирующих разведений можно осуществить за короткое время. [c.144]

Белок НА вируса гриппа весьма хорошо изучен как в структурном, так и в функциональном отношении. Это главный вирусный антиген, против которого направлены защитные антитела, и его вариабельность является основной движущей силой эволюции вируса, происходящей в ходе эпидемий. Некоторую информацию о структуре НА удалось получить с помощью прямого определения его аминокислотной последовательности. Однако полная первичная структура НА различных штаммов вируса гриппа А, а также некоторых штаммов вируса гриппа В была установлена только после применения методов молекулярного клонирования и быстрого секвенирования нуклеиновых кислот [41]. Полученные данные не только выявили степень родства между штаммами, но и были сопоставлены с расположением функциональных доменов и антигенных участков. Этому способствовало построение модели трехмерной структуры молекулы НА. НА — первый мембранный белок, чья структура была установлена методом рентгеноструктурного анализа. [c.455]

До недавнего времени большую часть информации относительно индукции и экспрессии Т-клеточного ответа на вирусы получали из опытов, проведенных in vivo на мышах. Однако два последних достижения — поддержание Т-клеток в культуре и их клонирование, а также получение моноклональных антител, специфичных к молекулам поверхности Т-клеток, — дали возможность изучать Т-клеточный ответ мышей и человека in vitro. Поверхностные молекулы определенного типа соответствуют индивидуальной функции Т-клеток и стадии их дифферент цировки (рис. 14.2). Таким образом, в зависимости от фенотипа [c.11]

ELISA применяется для обнаружения различных белков, идентификации вирусов и бактерий, а также определения низкомолекулярных соединений в широком спектре биологических образцов. Чтобы повысить специфичность первых антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. При этом для уменьшения стоимости прибегают к технике клонирования их фрагментов в Е. соИ и получают комби-наторггую библиотеку, а на ее основе - широкий спектр комбинаций Fv-фрагментов. [c.201]

Для генной терапии рака разработаны также комбинированные подходы, использующие две разные системы генов. В одном из них сочетаются G V-HSVi -терапия и генная иммунотерапия (рис. 21.12). Одну часть опухолевых клеток трансдуцируют геном HSV/Л, другую -клонированной кДНК (или геном) одного из цитокинов. Цитокины (интерлейкин-2, интер-лейкин-12 и другие) играют роль сигнала, мобилизующего клетки иммунной системы и стимулирующего иммунный ответ. Показано, что опухолевые белки, которые высвобождаются из клетки, уничтоженной в результате терапии с помощью гена самоубийства , взаимодействуют с иммунными клетками, привлекаемыми к месту локализации опухоли цитокином, и запускают противоопухолевую иммунную реакцию. Кроме того, противоопухолевые антитела, поступая в кровоток и циркулируя по всему организму, предотвращают появление метастазов. [c.503]

Неожиданная возможность изучать белки кинетохора у млекопитающих появилась, когда стало известно, что у больных некоторыми формами склерооермы (болезни неизвестной природы, связанной с прогрессирующим фиброзом соединительной ткани кожи и других органов), образуются антитела, специфически реагирующие с кинетохорами. Если такие антитела с флуоресцентной меткой использовать для окрашивания делящихся клеток, получается определенный рисунок флуоресцирующих пятен, каждое из которых отмечает положение кинетохора. Такой же пятнистый рисунок создается и в неделящихся клетках при этом число пятен в клетке соответствует числу ее хромосом (рис. 13-53), и можно думать, что какой-то предшественник кинетохора связан с каждой центромерой даже в интерфазном ядре. Антитела склеродермы сделали также возможным клонирование генов, кодирующих некоторые из [c.446]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Описанный метод был применен для детектирования новых антигенов на фибробластах, трансфецированных клонированными Я-2-генами (табл. 12-2). Мы обычно используем этот метод для Н-2- и 1а-типирования стимулированных Кон-А спленоцитов, которые также применяются как клетки-мишени для цитотоксических Т-клеток. Очень удобно, что эти клетки можно оставлять на холоду в течение ночи перед проведением теста связывания (табл. 12-3). Для стандартного Н-2- и 1а-типирова-ния мышей-беккроссов мы хирургически удаляем два или четыре шейных лимфатических узла и готовим клеточную суспензию. Эту суспензию можно разделить как минимум на пять порций в зависимости от набора моноклональных антител, которые будут использоваться для тестирования (если ожидают результат о наличии или отсутствии антигена, то нет необходимости считать клетки) (табл. 12-4). [c.228]

Исходные гибридные клетки могут иметь неклональное происхождение, особенно если гибридные колонии растут в большинстве ячеек. Они могут представлять собой смесь клонов-продуцентов и непроду-центов, а также смесь разных клонов-продуцентов. Для получения моноклональных антител необходимо, чтобы производящие их клетки были потомками единичных клеток. Достигается это последовательными этапами клонирования, которое осуществляется 2—3, а иногда и более раз. [c.200]

Основным классом условно-летальных мутантов, используемым для изучения функции парамиксовирусных генов, являются / -мутанты. Низкий уровень рекомбинации не позволяет построить карту парамиксовирусов с помощью генетических методов. Однако информация о взаимном расположении генов была получена в серии экспериментов по прерыванию процесса транскрипции вследствие УФ-повреждения матриц [13], а также с помощью методов молекулярного клонирования и секвенирования [16]. Описаны, но не нашли широкого применения природные и безусловно-летальные мутации. Правда, спонтанный мутагенез можно исследовать с помощью моноклональных антител. [c.479]

В основе онтогенеза лежит клональный иринцин ири половом размножении всякий многоклеточный организм являет собою клон клеток, происшедших из зиготы, а ири бесполом - дочерний организм есть попросту продолжение материнского клона поэтому бесполое размножение называют клонированием. Оказывается, нечто похожее происходит на всех уровнях развития За последние годы постепенно выяснилось, что многие структуры зародыша образуются из потомков небольшого числа клеток... Понятие клона возникло в иммунологических исследованиях, в которых было показано, что... одна иммунологически компетентная клетка начинает усиленно пролиферировать (многократно делиться -Ю. Ч.), а затем вырабатывает антитела... Позднее было показано, что многие опухоли также развиваются как клоны, происходящие из одной злокачественной клетки. Некоторыми примерами клонального развития может служить формирование зародыша... и ироисхождение больших участков центральной нервной [c.249]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология